PKM2在重型再生障碍性贫血髓系树突状细胞激活中作用的初步研究

In recent years, a large number of studies have shown that immune abnormalities played a crucial role in the pathogenesis of severe aplastic anemia(SAA). Our previous studies have demonstrated that the quantity and function of myeloiddendritic cells (mDC) were increased, may be the cause of the immune response in SAA patients. However, the reason which caused the activation of mDC was unclear. The applicants were mainly engaged in the research of immune pathogenesis of SAA, and the results of two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis have shown that expression of pyruvate kinase M2 isoform (PKM2)in mDC was significantly increased in SAA patients. This research intends to work on the basis of preliminary studies to explore the role of PKM2 in the process of mDC activation in SAA patients and SAA mouse models. We intend to analyze the changes of PKM2 protein and mRNA levels in mDC in SAA patients and its correlation with the immune state of SAA patients, establish cell models in vitro and SAA mouse model to elucidate the effects of PKM2 on mDC proliferation, function,activation and T cells activation, and investigate the influence of immunosuppressive drugs and interference plasmid on PKM2 function. This research aim to further clarify the immune pathogenesis of SAA, to provide the experimental basis for the treatment of SAA on PKM2.

近年来大量研究显示重型再生障碍性贫血（SAA）发病与免疫异常密切相关。我们既往研究发现SAA患者髓系树突细胞（mDC）数量增多、功能增强，，可能是导致一系列免疫反应的重要因素，但激活mDC的成因尚不明确。申请人近年来主要参与SAA免疫发病机制的研究，采用差异双向电泳研究显示SAA患者mDC中丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）表达明显增高，本次课题研究拟在前期研究工作的基础上，以SAA患者及SAA小鼠模型为研究对象，对PKM2在mDC激活过程中所发挥的作用进行深入探索。分析SAA患者mDC细胞内PKM2蛋白及mRNA水平的变化及其与SAA患者免疫状态的相关性；建立体外细胞模型及SAA小鼠模型阐明PKM2对mDC细胞增殖、功能、活化及激活T细胞作用的影响；探讨免疫抑制剂及干扰质粒对PKM2功能的影响。通过上述研究进一步明晰SAA的免疫发病机制，为开辟基于PKM2治疗SAA提供实验基础。

重型再生障碍性贫血（SAA）是一组血液系统重症，特点为全血细胞重度减少和骨髓造血功能衰竭。目前认为自身免疫性T细胞功能亢进是SAA发病的主要免疫机制。近年来研究表明，髓样树突状细胞数量(mDC)增多、功能亢进，引起Th1细胞比例升高，I型淋巴因子(IL-2、IFN-γ)分泌增多，引起细胞毒性T细胞（CTL）功能亢进，从而导致造血功能衰竭。虽然SAA免疫发病机制已经日趋完善，但激活mDC，进而引起机体一系列异常免疫机制的诱因仍不清楚。因此，探索诱发SAA患者mDC细胞激活的原因，对于深入揭示SAA的免疫发病机制，明确其发病机理具有重大意义。丙酮酸激酶M2型（PKM2）是细胞糖酵解通路的关键酶，近年来研究表明，PKM2与细胞免疫关系密切，与众多自身免疫性疾病发病息息相关。我们的前期通过蛋白组学研究显示，与正常人的mDC细胞相比，SAA患者mDC细胞内PKM2表达上调。因此本课题对SAA患者mDC内PKM2表达水平，及其对mDC和下游效应T细胞的影响进行了研究，发现SAA患者mDC内升高的PKM2参与了mDC活化过程，刺激下游CTL功能分子表达水平升高，从而增强对靶细胞的杀伤作用，在细胞和分子水平上探讨了PKM2控制mDC的过度免疫反应、维持免疫稳态及调控SAA自身免疫状态的机制。成功建立SAA小鼠模型，在动物实验中证实了PKM2对mDC细胞和T细胞的激活作用。SAA小鼠mDC细胞内的高PKM2表达促进了细胞的糖酵解代谢水平，为mDC细胞及下游T细胞增殖和活化创造了物质和能量条件。当使用免疫抑制剂或PKM2抑制剂后，随着PKM2表达水平的下降，SAA小鼠体内过度亢进的免疫状态得以遏制，mDC细胞糖酵解代谢水平也出现整体下降趋势，血象逐渐恢复，生存率较未治疗组明显增加。总之，我们进一步明确了PKM2在SAA患者mDC及效应细胞功能激活中发挥重要作用，通过调控及影响SAA免疫瀑布的上游始动环节参与疾病的发生发展。PKM2可以成为评估SAA病情严重程度、疗效及预后的指标，同时也为研究细胞代谢在SAA机体免疫中的作用提供新的思路，为明确SAA免疫发病的根本病因提供基础。