神经肽Y通过β-arrestin 2调节巨噬细胞肿瘤坏死因子α分泌的机制

神经系统与免疫系统之间存在双向调节作用，交感神经末梢释放的神经肽Y（NPY）具有重要的免疫调节作用。我们的研究也表明，NPY能够通过其I型受体（Y1R）促进巨噬细胞LPS引起的TNF-α产生，但是机制不明。近年研究发现，一类具有募集和支架功能的分子，β-arrestin 2（β-arr2），能够反馈性抑制TLR4信号的激活，是巨噬细胞内的重要炎症负向调节因子。我们前期实验发现，NPY可以快速引起其受体内吞，同时介导Y1R内吞的β-arr2从胞浆向胞核转移。由此，我们推测NPY引起β-arr2向胞核转移，从而抑制其负向调节作用，促进LPS引起的TNF-α产生。本项目拟采用RNAi、EMSA和co-IP等方法，研究NPY对β-arr2的作用及其分子过程，以期阐明NPY通过β-arr2调节巨噬细胞TNF-α产生的作用及其分子机制，为NPY作为神经免疫炎症相关疾病防治的新靶点提供更充分的科学依据。

本课题以小鼠巨噬细胞为研究对象。首先，采用LPS刺激巨噬细胞造成炎症激活。在此基础上，检测NPY对炎性因子分泌的影响，并通过代谢组学技术，研究NPY对小分子炎性介质分泌的影响。进一步，通过分别提取NPY作用下巨噬细胞胞核和胞浆部分的蛋白质组，应用2D-nano-LC-MS/MS技术获得关于蛋白质组的变化信息，从中推测可能的NPY的作用机制；针对蛋白质组学得出的结果以及NPY可能的信号通路，研究NPY炎性调节的分子机制，具体内容包括：.　　1. 应用LPS刺激巨噬细胞造成的炎症，发现NPY能够抑制炎性因子TNF-α、L-1β、L-6的产生，有趣的是，我们发现NPY也能够显著提高巨噬细胞晚期炎症因子HMGB1的分泌，而且该作用并非由于巨噬细胞坏死所导致的被动释放，而是巨噬细胞的主动分泌所致。我们发现NPY能够快速提高HMGB1mRNA的转录，其较LPS的作用更快。接下来，应用代谢组学技术检测了LPS处理组和NPY+LPS处理组上清中小分子代谢物的变化。结果显示NPY改变了炎症激活巨噬细胞的分泌模式，能够显著下调脂氧素A4和前列腺素B2的分泌。.　　2.为了探索 NPY的作用机制，我们采用了基于2D-nano-LC-MS/MS的高通量蛋白组学研究技术，研究RAW264.7细胞在10-8mol/L NPY处理后，不同亚细胞结构蛋白表达的差异，探索NPY炎性调节可能的信号途径。经过NPY处理后，共有435个蛋白的表达出现变化，涵盖了复杂的功能领域，包括能量代谢、细胞骨架、核酸代谢和炎症功能等。我们选取了跟炎症功能相关的蛋白进行探讨。发现NPY可能通过改变其受体介导内吞过程中的连接分子β-arrestin 2的空间分布发挥炎症调节作用，影响炎症因子表达。. 3. NPY主要通过Ⅰ型受体发挥作用，但关于NPY的作用机制罕有报道。结合第1部分和第2部分的结果，推测NPY对TNF-α调节是和β-arrestin 2分子向胞核转运过程相关。在细胞水平我们发现NPY作用下β-arrestin 2分子向胞核转移。同时在NPY作用下，LPS引起的NF-κB p65亚基的入核量减少，说明NF-κB控制的炎症转录过程受到抑制。通过阻断Gq下游的PKC通路和MEK通路，我们发现NPY增强HMGB1mRNA水平的作用被阻断，说明NPY促进HMGB1表达分泌是通过PKC/MEK/ERK通路介导的。