TNF-α诱导蛋白-8 样分子1介导脓毒症后树突状细胞免疫功能障碍及机制研究

Tumor necrosis factor-α-induced protein-8 like-1 (TIPE1) has recently been identified as a novel regulator gene, and studies in mice and humans have suggested its regulatory action in tumor. In our previous study, we found that TIPE1 was closely related to cellular autophagy and apoptosis. However, fundamental questions regarding the mechanisms underlying the regulation of TIPE1 on dendritic cells (DCs) remain unresolved. As important antigen presenting cells, the functional status of DC directly affects the differentiation and proliferation of T cells. The present study was performed to investigate the changes of TIPE1 expressions in DCs, and its regulatory mechanism of TIPE1 in mediated DC cellular immune dysfunction after sepsis. Using cells or mice model of TIPE1-knockdown or TIPE1-overexpression, interventions with the key molecules in the signaling pathway of PD-L1/PD-1, including PD-L1, PD-1, SHP1/2, PI3K, and Akt, would be used both in vitro and in vivo to evaluate the possible influence of TIPE1 on DCs together with underlining signal transduction. Our findings will help to clarify the role and significance of TIPE1 in immunomodulation of DCs, thus shed a light to the development of novel therapeutic strategies for improving the host immune response and the clinical outcome of patients with acute insults and subsequent sepsis.

目前诸多研究关注肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8 样分子1(TIPE1)的肿瘤调节效应，我们新近资料提示TIPE1与细胞自噬及凋亡密切相关，但其调控途径迄今缺乏了解。我们前期研究发现，TIPE1在树突状细胞(DC)中表达，并在小鼠脓毒症模型中呈现高表达。DC作为重要的抗原提呈细胞，其功能状态直接影响T淋巴细胞的分化和增殖。因此，本项目拟研究TIPE1在DC中的表达规律，探讨其与脓毒症后DC免疫功能障碍的内在联系。并采用TIPE1基因敲除/过表达小鼠模型，通过对PD-L1/PD-1信号通路中关键调控分子PD-L1、PD-1、SHP1/2、PI3K、Akt表达或活化进行干预，结合体内外实验从不同层次深入分析脓毒症后TIPE1介导DC免疫反应及其信号调节环节。该项目从新的角度进一步认识TIPE1在介导DC免疫效应中的重要作用与信号机制，为探索脓毒症后免疫功能障碍发病过程及其调理策略开辟新途径。

研究背景：肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子1(TIPE1)可能具有负向调控作用，但其调控途径尚缺乏了解。本研究主要探讨TIPE1介导DC免疫功能障碍及其信号机制。.主要研究内容：通过小片段RNA分别干扰和过表达TIPE1在DC细胞中的表达，体内实验采用CLP小鼠模型，并采用TIPE1敲除小鼠。通过DC表面分子CD80、CD86和MHC-II表达程度，细胞因子IL-12和TNF-α分泌水平等相关指标反映DC细胞的功能状态，并进一步分析DC对T淋巴细胞功能的影响。同时通过Western blot、激光共聚焦等实验技术检测PD-L1/PD-1信号分子表达。明确TIPE1与DC免疫功能状态，介导T细胞增殖反应以及相关信号通路（PD-L1/PD-1）的内在联系。.重要结果：1.TIPE1在DC内存在基因和蛋白表达。2.体外实验，CD80、CD86及MHC-II表达及IL-12p40、TNF-α生成量在TIPE1沉默DC组显著增强。CLP 24 h后，TIPE1-/-组DC表面3种分子表达及细胞因子生成量均较CLP组出现上调。3.敲低TIPE1后T细胞增殖活性、IL-2水平及T细胞NF-AT活性较正常组增强。TIPE1沉默后，IFN-γ含量增加，IL-4水平降低，提示TIPE1促进T细胞向Th2方向分化。3. 敲低DC2.4中TIPE1表达后，T细胞内PI3K和Akt表达增加，采用抗PD-L1抗体以抑制PD-L1活性及PD-L1/PD-1结合，检测到PD-1和SHP-2表达均较未加抗PD-L1抗体前不同程度减弱。4.CLP后CD4+T细胞PD-1和SHP-2表达水平上调，而TIPE1-/-CLP小鼠CD4+T细胞PD-1和SHP2表达下调，PI3K和Akt蛋白表达升高。抗PD-L1抗体应用后，TIPE1敲除后，CD4+T细胞PD-1和SHP-2表达降到最低，相反PI3K 和Akt 蛋白表达量增加。5.TIPE1沉默后，人外周血DC细胞表面CD83、HLADR、PD-L1平均荧光强度升高，T细胞增殖活性增加，T细胞向Th1方向分化。 .科学意义：TIPE1可能通过PD-L1/PD-1信号通路影响脓毒症小鼠DC细胞的分化成熟及其介导的T淋巴细胞功能。