胶质瘤细胞中GDNF基因启动子激活机制的研究

胶质瘤细胞中胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）表达显著升高，我们已证实其mRNA表达水平增加，提示胶质瘤中GDNF基因表达升高主要受转录水平的调控。GDNF基因具有双启动子，本项目拟证实胶质瘤细胞哪个启动子被激活及调控该启动子活性的机制是什么。预实验发现，胶质瘤中GDNF基因两个启动子之间部分DNA发生了高甲基化修饰。我们推测：该调控元件的高甲基化修饰，导致其上游启动子Ⅱ沉默，而激活了下游启动子Ⅰ，并影响了GDNF mRNA前体的选择性拼接；此调控元件高甲基化可能与启动子区组蛋白修饰有关。本项目拟采用siRNA导向转录沉默（RdTS）技术检测GDNF基因各启动子激活情况，探索其与mRNA亚型表达的关系；构建特异表达载体检测前述调控元件甲基化修饰前后对启动子活性的影响；采用染色质免疫沉淀分析（ChIP）探讨DNA高甲基化水平与启动子区组蛋白修饰的关系。本项目有助于揭示胶质瘤发生发展机制。

在表观遗传学中，基因启动子区甲基化修饰减少和组蛋白H3K9高乙酰化被普遍认为是基因高转录的原因。本研究的预实验已经证明胶质瘤细胞中胶质细胞系源性神经营养因子（gdnf）mRNA表达显著增加，而正常脑组织、低级别、高级别胶质瘤组织中gdnf基因启动子区的碱基序列并没有发生变化，据此我们认为导致胶质瘤中gdnf高表达的原因发生在表观遗传层面上。本项目以正常脑组织、低级别、高级别胶质瘤组织为研究对象，检测了gdnf基因2个启动子的甲基化修饰情况，并筛选出4种与特异性改变gdnf启动子区甲基化修饰的转录因子，检测了其与目的基因启动子区结合程度的改变情况；以及这些组织中gdnf基因启动子I区和II区组蛋白H3K9的乙酰化水平。通过组蛋白乙酰基转移酶抑制剂curcumin和去乙酰化酶抑制剂trichostatin A（TSA）处理胶质瘤细胞，检测对gdnf基因启动子乙酰化水平、启动活性以及该基因mRNA表达水平的影响。本项目研究结果表明：（1）与正常脑组织相比，胶质瘤中gdnf基因启动子I区甲基化修饰水平普遍升高；在低级别胶质瘤中gdnf启动子Ⅱ区甲基化水平明显下降，且降低的位点主要位于增强子区，而在高级别胶质瘤中明显上升，且升高的位点主要位于沉默子区。（2）gdnf基因启动子区甲基化修饰变化引起了4个转录因子与其碱基对结合量的改变。这4个转录因子包括AP-2、SP1、ERG-2和CREB，随着胶质瘤病理级别的增高，这些区域特异性结合的转录因子与DNA的结合量呈现下降的趋势，且高级别组与正常脑组织组间差异显著。（3）与正常脑组织相比，gdnf基因启动子I区和II区H3K9乙酰化水平在高级别胶质瘤组织中显著升高，而低级别胶质瘤组织中未见显著改变；在胶质瘤细胞中，当curcumin显著降低了gdnf基因启动子II区H3K9的乙酰化水平和启动活性时，gdnf基因mRNA的表达水平也显著下调；而当TSA显著增加了gdnf基因启动子II区H3K9的乙酰化水平和启动活性时，gdnf基因mRNA的表达水平也显著升高。本项目从表观遗传学层面上探索胶质瘤中gdnf基因高转录的原因，有助于治疗胶质瘤药物的设计。