电活化的转基因嗅鞘细胞与新型导电组织工程支架促进大鼠损伤视神经的修复

The optic nerve (ON) belongs to the central nervous system and can hardly regenerate spontaneously after ON injury. Although bridging the transected ON and its target with an autolougous peripheral nerve graft can induce the regeneration of the injured ON and thus restore partial visual function, the resourse of clinical donors is rather difficult.Therefore, developing the substitutes for the peripheral nerves has an important application significance. In the present project, we plan to (1) add conductive polypyrrole into the previous collagen bio-engineering conduit with the longitudinal microtubules and screen the optimal parameters for ON regeneration, thus preparing a new conductive conduit; (2) transfect ciliary neurotrophic factor which can specificly enhance ON regeneration into olfactory ensheathing cells (OECs) which are capable of protecting injured retinal ganglion cells and remyelinating central axons; and (3) activate the CNTF-transgenic OECs with direct current and develop a new composite conductive conduit. The new composite conduit is to be further transplanted in between the transected ON and the contralateral superior colliculus. Continuous in vivo electrical stimulation of the conduit will be used to maintain the activation of transgenic OECs and regenerating ON axons will be enhanced to grow whithin the conduit to the superior colliculus. It is expected that the synaptic conection will be formed in the colliculus and partial visual fuctions will be restored. We hope that the present project can provide a new bio-engineering conduit to repair ON injury in human patients, and exploration of the mechanisms underlying the effects of direct current signals on OEC activation can provide theoretical basis for the production of new seed cells in the bio-engineering organs.

视神经属中枢神经，损伤后难以自发再生。以自体周围神经桥接离断的视神经及其靶组织可诱发视神经再生并恢复视觉功能，但临床供体来源困难，使开发周围神经替代品具有重要应用意义。本项目拟首次在胶原组织工程支架内加入聚吡咯导电材料，并筛选出适合视神经再生的最佳支架参数，制备成优化的新型导电仿生神经支架。将可促进损伤视网膜节细胞存活并对中枢神经具有独特成髓鞘功能的嗅鞘细胞，转染具有特异性促进视神经再生作用的睫状神经营养因子，接种于支架内并以直流电体外激活。将此新型复合导电仿生支架桥接于大鼠离断视神经与靶组织上丘间，持续体内电刺激支架以维持嗅鞘细胞的活化并促进视神经再生，使再生视神经在复合支架中靶向递送至上丘并形成突触联系，进而恢复部分视觉功能。本项目有望为临床提供修复视神经损伤的新型组织工程支架，探讨直流电对支架内转基因嗅鞘细胞的调控及其机制，还可为组织工程器官中新型种子细胞的构建提供理论依据。

本项目主要研究内容是: 研制促进视神经再生的人工合成生物支架、对视神经损伤修复的环境等方面的条件进行探索，以期将细胞移植、电场和神经营养因子等综合因素通过生物支架的移植以促进视神经的再生修复。项目实施情况是：根据项目计划要求，不断克服生物支架制备中存在的问题和困难，制备符合动物视神经损伤移植的生物支架材料；研制支架材料的同时，通过腺相关病毒（AAV）携带睫状神经营养因子（CNTF）以及脑源性神经营养因子（BDNF）等神经营养因子核酸序列眼内注射，观察CNTF和BDNF在动物（大鼠）自体坐骨神经移植条件下视神经残段再生的情况；分离并培养大鼠嗅鞘细胞，以备移植之用；探索支链氨基酸、电针穴位刺激和依托咪酯等外源性药物和物理刺激对视神经损伤后的神经保护和促进神经再生的作用。在生物导电仿生支架研制屡屡受挫的情况下，一方面不断改进支架制备的工艺和制备策略，另一方面积极探索其他促进视神经损伤修复的条件，努力完成项目的计划。除了制备新型导电组织生物工程支架外，本项目的研究目标基本完成：生物支架材料仍在继续改进中，以3D打印壳聚糖与胶原材料相结合，并附加梯度神经营养因子的支架材料已经完成粗制样品；已经通过AAV携带神经营养因子眼内注射证实在自体周围神经移植条件下，大鼠视神经再生可得到极大的促进，视网膜神经节细胞轴突残段可以在该条件下再生长入上丘，并形成有部分神经功能的突触；4/20Hz电针刺激大鼠睛明穴等部位可通过改善谷氨酸代谢而显著保护损伤的视网膜神经节细胞；支链氨基酸通过mTOR信号途径以及依托咪酯通过视网膜GABAa受体保护损伤的视神经，并在一定范围内促进视神经再生修复。截止结题时，项目的部分研究结果发表在Experimental neurology, Current Eye Research, Neuroscience letters等专业期刊上，另有部分研究结果仍在整理或投稿中。该项目培养博士研究生3名，硕士研究生2名，均已按期顺利毕业；共发表SCI期刊研究论文5篇，综述1 篇，参编专业著作1部。