钙离子对微囊藻细胞壁合成及群体集聚状态影响机理的研究

Cytological mechanism of Microcystis bloom is poorly understood. Colonial aggregation is very important for Microcystis to get ecological advantages. However most isolated strains lose colonial form and become unicellular during laboratory culture. Few researches are published focused on colonial aggregation. We studied a colonial strain XW01 and found that high Ca2+ concentration could increase its aggregation. Based on the preliminary studies, in this proposal, we plan to study effects of the cell wall synthesis on the colonial aggregation by ways of molecular biotechnology, cell wall structure analysis, and physiological metabolism measurement in different Ca2+ concentrations. We intend to sequence full genome of XW01 and find out key genes of cell wall synthesis; use gene chips and proteomics means to screen colonial aggregation-related genes; use RT-PCR, gene knockout and Western blot to confirm the key role of the cell wall synthesis genes for aggegation; use laser scanning confocal and electronic microscopy, MALDI-TOF-MS to determinate cell outer wall composition and structure, especially the polysaccharide layer and S-layer protein; use ion-select electrode, specific fluorescent dyes and other methods to study the relationship of Ca2+ and the key gene expression. Ultimately, we would reveal the detail mechanism of cell wall synthesis affecting the aggregation.

缺乏对微囊藻水华形成细胞学机制的了解，是未能有效控制水华的重要原因之一。群体集聚状态是微囊藻获得生态优势的关键，但由于大多数培养的藻株失去了群体形态，目前对群体集聚的研究报道十分有限。前期对群体形态的微囊藻XW01研究发现：高Ca2+浓度有促进群体集聚的作用。本课题拟从分子遗传、细胞壁结构、生理代谢3个层面研究Ca2+与细胞壁合成及群体集聚的关系。拟测定XW01基因组全序列，通过数据库比对找出细胞壁合成相关基因；利用基因芯片、蛋白组学手段发现与群体集聚相关的关键基因，并通过基因敲除、RT-PCR、Western blot等手段确认这些基因的作用；采用激光共聚焦和电子显微镜、MALDI-TOF-MS等方法，测定细胞外壁多糖、S-layer蛋白等结构和组成的变化；用离子选择电极、特异荧光染料等方法，研究Ca2+调控与关键基因表达的关系。最终揭示细胞壁合成影响群体聚集状态的代谢机理。

对滇池、太湖的微囊藻水华控制虽然投入了大量的人力物力但迄今成效甚微，对水华形成机理缺少足够的认识是其重要原因。群体状态是微囊藻获得生态优势的关键，但群体形成的机制尚未明晰。前期研究发现，Ca2+对群体集聚有显著促进作用，本项目主要基于分离培养获得的稳定群体状态的微囊藻藻株XW01和单细胞模式藻株PC7806为材料，比较研究了Ca2+对群体与单细胞微囊藻的不同作用，同时探索了细胞表面S-layer蛋白的结构特征及其在群体集聚中的作用。研究结果显示：1）高Ca2+浓度有显著促进微囊藻细胞壁多糖合成的作用，通过用X-射线能谱仪分析、采用激光共聚焦扫描显微镜分析分析细胞Ca2+浓度，离子选择电极方法测定了钙离子与细胞壁多糖的结合能力，NMT非损伤微测技术测定了细胞对Ca2+的吸收能力，结果显示：群体微囊藻有更强的Ca2+结合能力和吸收能力。基因转录组的测定结果表明，在高Ca2+条件下，有60个基因表达上调，42个基因表达下调，包括4个二元信号转到系统的基因和一个糖基转移酶基因；2）比较分析发现，群体微囊藻XW01细胞壁具有非常丰富的S-layer晶体结构层，通过蛋白分离纯化、质谱分析鉴定从中筛选鉴定出了PCC7806中相关的基因CAO89090.1，氨基酸序列分析表明该蛋白符合S-layer特征。将该基因在集胞藻PCC6803中过量表达，确认了S-layer蛋白具有显著促使细胞形成群体的作用。. 此外，为探索水华形成机理探索了低温冷激对群体微囊藻越冬细胞生理状态的影响：研究表明，一定强度的冷激锻炼会提高微囊藻细胞的抗氧化系统活性，提高微囊藻的越冬能力，为来年的复苏提供更多的种源；为建立更简便的微囊藻毒素检测技术，从羊驼噬菌体展示抗体库中筛选3个高灵敏度、高稳定性的微囊藻毒素纳米抗体基因，经克隆表达出了高效抗体，为开发出更便捷的ELISA法检测微囊藻毒素奠定了基础。