基于自噬ERK2/TFEB/LAMP-1通路研究脑络通方“泄毒活血”治疗血管性痴呆的机制

Vascular Dementia(VD) is closely related to the increase of cell misfolded protein after the neuron under ischemia-hypoxia injury, accumulation of damaged cell organelle and “inner-produced turbid toxins” ,which will finally cause cell apoptosis.It is in accordance with the idea of “Toxicant Elimination and activating blood circulation” that the autophagy-lysosomal pathway will be activated,and degrade the harmful substances. In the early stage, the research group focused on pathological characteristics of VD brewing toxin and harming marrow and took disinfection, invigorating the circulation of blood and expelling phlegm as the therapeutic method to treat VD by using Naoluotong prescription, the clinical effect proved to be satisfactory.It turned out such protection is related to autophagy, while the specific mechanism is not clear. Therefore, based on the preliminary work, the research team proposed the idea that “mechanism of Naoluotong granule resisting VD may be related to its promoting the timely degradation of autophagosome and effect of turbidity and Toxicant elimination”. The project plans to apply the animal model of VD by ligating bilateral carotid arteries and oxgen-glucose deprivation-induced cell model, by testing key protein of autophagy-lysosomal pathway to study from in-virto experiment and in-vivo experiment about whether Naoluotong granule can enhance autophagy degradation, eliminate turbidity and toxicant, maintain the stable condition in cells and exert neuro-protective effect through autophagy ERK2/TFEB/LAMP-1 access.

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）的发生与神经元缺血缺氧损伤后细胞异常折叠蛋白增多、受损细胞器蓄积、“内生浊毒”，最终诱发细胞凋亡有关；细胞内自噬-溶酶体途径激活、降解聚集的有害物质，则合“泄毒活血”之理。本课题组前期针对VD酿毒损髓的病机特点，以泄毒活血化痰为治疗方法，使用脑络通方临床治疗VD 取得了较好疗效，预实验发现这种保护作用与自噬相关，但其具体作用机制尚不明确；因此，在前期工作基础上，本课题组提出“脑络通方抗VD的机制可能与其促进自噬体及时降解，发挥泄浊排毒之功效有关”。本项目拟应用双侧颈总动脉结扎导致VD的动物模型，以及氧糖剥夺的细胞模型，通过检测自噬-溶酶体途径关键蛋白，从体外实验和体内实验研究脑络通方是否通过自噬ERK2/TFEB/LAMP-1通路，增强自噬体降解、泄浊排毒，维持细胞内环境稳态，发挥神经保护作用。

血管性痴呆(VD)是一种由脑血管疾病引起的认知功能障碍综合征，慢性脑血流低灌注(CCH)与其发病密切相关。自噬是细胞利用溶酶体降解和循环利用细胞内生物大分子和细胞器的过程。轻度和中等水平的自噬对缺氧缺血神经元起到保护作用，但过度激活自噬会加剧神经元死亡。如何抑制过度自噬，发挥其保护神经元的作用成为当今研究热点。前期临床研究表明，脑络通(NLT)能改善VD患者的认知功能和日常生活能力，但作用机制尚不清楚。因此，探讨NLT是否通过抑制过度自噬发挥神经元保护作用。.项目主要研究内容：.1.观察动物行为学变化，分析NLT对VD大鼠学习和记忆功能的影响：①建立VD模型，假手术组；VD组（结扎双侧颈总动脉）；高、中、低剂量NLT治疗组；阳性药物对照组（多奈哌齐0.5g/kg）。每组分为1、2个月组；②.使用Morris水迷宫对大鼠进行行为学功能监测，通过定位航行实验和空间探索实验；.2.通过透射电镜超微结构观察，分析NLT对VD大鼠海马病理组织及海马神经元超微结构的干预效果；体外培养PC12细胞，应用TUNEL（绿色荧光）细胞凋亡检测法，分析NLT对PC12细胞凋亡和自噬的干预作用；利用应用IHC法、Western-blot法、Rt-PCR法检测ERK/TFEB/LAMP-1信号通路和自噬相关相关因子LC3、Beclin1、LAMA-1、ERK、TFEB、p62的蛋白和mRNA表达的变化，分析NLT对VD大鼠海马组织ERK/TFEB/LAMP-1信号通路和自噬的调控作用；拟采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）法对NLT的成分进行分析。.本次研究发现：. 1.动物行为学研究：NIT组能够改善VD大鼠的认知功能，其中大剂量组改善VD大鼠的认知功能与阳性对照组相似。.2.病理学和分子生物学研究：①VD诱导过度自噬和细胞凋亡；②NLT通过下调自噬改善学习记忆能力；③体外实验证实NLT通过下调ERK/TFEB/LAMP-1信号通路发挥神经保护作用；④NLT的抗脑缺血作用可能是通过下调ERK/TFEB/LAMP-1信号通路发挥神经保护作用；因而我们得出结论NLT通过抑制ERK/TFEB/LAMP-1信号通路而下调自噬，从而改善认知功能。.本研究为NLT治疗VD提供了理论依据，并为VD的中医病机认识和治疗提供新的作用靶点和实验证据。