印迹基因H19通过miR-675途径调节胎盘发育的作用机制研究

So far knowledge on functions of imprinted gene H19 has been largely derived from H19 knock-out mice. However, due to the imprinting linkage of H19 with IGF2 gene,the phenotype of H19-knockout mice was most likely resulted from overexpression of IGF2. The real function of H19 itself remains to be clarified. Recent evidence suggested that H19 coule encode the precusor of miR-675, indicating a possible post-transcriptional mechanism of H19 function. We therefore proposed that miR-675 pathway may be critical for H19 function in placenta development. In this project, we will first determine the involvement of miR-675 in the effects of H19 on human trophoblast cell proliferation and differentiation by using cultured human trophoblast cells and mouse trophoblast stem cells. The target genes and the critical signaling pathways of miR-675 will be further identified to find the molecular basis of H19-miR-675 modulating trrophoblast cells behaviors. Furthermore, we will generate H19/miR-675-placenta-specific knock-down mice model. Through phenotype analysis and functional "rescue" experiment in these mice, we are aiming to clarify the molecualr mechanism whereby H19 regulates placenta development via miR-675 pathways.

长期以来对H19基因功能的认识是基于基因敲除技术，但由于H19基因和IGF2基因的连锁印迹，H19基因敲除小鼠的表型可能是由于IGF2的表达上调所。因而对H19基因功能的认识亟待深入。新近研究发现H19可以编码miR-675前体，表明H19基因可能存在一种转录后调控作用机制。因此我们推测H19-miR-675途径可能是H19调节胎盘发育的重要作用途径。本项目拟在人滋养层细胞系和小鼠滋养层干细胞等体外模型中研究印迹基因H19通过编码miR-675对滋养层细胞增殖和分化等行为的影响，并通过鉴定miR-675的靶基因及其作用的信号通路，阐释miR-675调控滋养层细胞功能的分子机制；同时建立H19和miR-675胎盘特异性敲降小鼠模型，在整体水平上进行表型分析和功能挽救实验，阐明H19-miR-675作用途径在胎盘发育过程中的作用机制。

H19和IGF2是首先被鉴定的印迹基因，H19基因被认为在胎盘发育中具有重要的作用。但是，目前对H19基因的相关机制研究尚不清楚。近期研究表明H19是编码miR-675前体，H19基因可能通过调控miR675的一种转录后调控作用机制参与发育过程。基于以上背景，本项目假设H19-miR-675途径可能是H19调节胎盘发育的重要作用途径。我们利用人滋养层细胞系和小鼠滋养层干细胞等体外模型研究了鼠早期胚胎及胎盘发育过程中H19和miR-675的定位与表达，发现H19和miR-675均在人孕早期绒毛中有较高的表达；原位杂交的结果显示H19主要在绒毛细胞滋养层和滋养层柱中高表达，且miR-675与H19在人早孕绒毛中存在共定位。接下来，探讨了印迹基因H19通过miR-675作用途径对人滋养层细胞功能的影响及机制。H19 可作为miR-675的前体，抑制细胞滋养层细胞系的增殖，有可能是通过miR-675作用与靶基因NOMO1而激活TGF-B相关信号通路实现的。同时，对小鼠滋养层干细胞的影响研究显示，H19能促进小鼠滋养层干细胞增殖，而miR-675也参与其中，对其分化也有一定的影响。为了深入阐明H19-miR-675作用途径在胎盘发育中的作用机制，我们建立了慢病毒介导的胎盘特异性H19基因敲降小鼠模型，经过鉴定发现小鼠胎盘无明显的病理表型。因此，我们进一步鉴定了miR-675在子痫前期患者血浆中的表达，发现miR-675在PE患者血浆中表达显著升高，H19及其预测的结合蛋白在PE胎盘中也呈高表达。我们首次发现H19结合蛋白HuR与miR-675可以抑制滋养层细胞的侵润功能。这有可能是H19-miR-675参与胎盘发育功能及PE病理相关机制的重要通路，对于阐明H19-miR-675发挥作用的机制有着重要的意义。