E3连接酶MDM2泛素化调节Akt在乳腺癌进展及赫赛汀耐药中的作用及机制研究

MDM2 and Akt oncoproteins are overexpressed in the majority of breast cancers, and their overexpressions are closely related to poor prognosis and therapy resistance. We observed a direct physical interaction between endogenous MDM2 and Akt, which promotes epidermal growth factor (EGF)-induced Akt ubiquitination and phosphorylation/activation in mouse embryonic fibroblasts. As an important E3 ubiquitin ligase, MDM2 may be engaged in Akt ubiquitination, but the exact mechanisms and the possible roles in breast cancer progression and resistance to Herceptin treatment remain unclear. Through Co-immunoprecipitation (Co-IP) assay, Glutathione-S-transferase (GST)-Pull Down assay, in vivo and in vitro ubiquitination assays, and confocal immunofluorescence, this grant will study the specific mechanisms by which MDM2 regulates Akt ubiquitination, membrane recruitment, phosphorylation/activation, and nuclear trafficking of the activated form of Akt. Further, in breast cancer models which are highly correlated with the EGFR signaling, we will explore whether MDM2-mediated Akt ubiquitination is involved in breast cancer progression and Herceptin resistance. Our results will provide proof-of-principle that MDM2 targeting is a compelling therapeutic strategy as a combinatory therapy for breast cancer treatment.

癌蛋白MDM2和Akt在多数乳腺癌中均有过度表达，与患者预后较差及治疗抵抗关系密切。我们首次发现MDM2可与Akt蛋白结合，在小鼠胚胎成纤维细胞中促进EGF诱导的Akt泛素化及磷酸化活化。MDM2作为重要的E3连接酶，可能参与了Akt的泛素化调控，但其机制及在乳腺癌进展和赫赛汀耐药中的作用不明。本项目将通过Co-IP、GST-Pull Down、体内和体外泛素化实验、激光共聚焦等实验探索MDM2作为Akt泛素化E3连接酶的可能性，阐明该泛素化诱导Akt膜转位、磷酸化活化、促进pAkt核内移位、协助完成后续信号传递的分子机制，并借助与EGF及其受体关系密切的乳腺癌模型，探讨MDM2介导Akt泛素化是否参与乳腺癌的进展及赫赛汀耐药，最终形成以抑制MDM2泛素连接酶活性为基础的药物联用，提高单纯以Akt为靶点的靶向治疗效果的思路，为控制乳腺癌进展及增强赫赛汀治疗敏感性提供理论基础及实验依据。

本项目主要研究MDM2在Akt泛素化和活化中的调控机制，以及该机制对乳腺癌的进展及赫赛汀耐药的影响。主要研究成果如下：①已完成MDM2和Akt在细胞内的定位检测，体内和体外实验验证MDM2可通过泛素化修饰活化Akt，并用雷公藤验证了MDM2与Akt互作关系的机制及后续效应：我们发现雷公藤可以干扰MDM2与转录因子REST的结合，通过PI3K亚基p85阻断Akt磷酸化活化，抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡和G1期阻滞，同时增强肿瘤细胞对阿霉素化疗的敏感性。②我们研究了HER2阳性乳腺癌组织MDM2表达与曲妥珠单抗耐药的相关性，发现MDM2、p53和PTEN等信号途径可能对曲妥珠单抗耐药产生影响。收集接受曲妥珠单抗治疗HER2过表达乳腺癌患者手术切除的存档标本，免疫组织化学方法检测癌组织中MDM2、p53、PTEN的表达，分析它们之间及与临床病理因素和预后的相关性。发现HER2阳性乳腺癌组织中MDM2高表达与PTEN表达缺失关系密切，并与曲妥珠单抗耐药相关，可作为预测和评估乳腺癌曲妥珠单抗疗效的生物学指标。③对MDM2的拓展研究观察到，同Akt一样，MDM2对另一个肿瘤进展中的重要蛋白VEGF也具有调控作用。在乳腺癌细胞和动物模型中用小干扰RNA抑制MDM2后观察对VEGF合成以及裸鼠移植瘤组织内血管生成的影响，发现siRNA抑制MDM2表达后，乳腺癌细胞分泌VEGF蛋白显著减少，裸鼠荷瘤组织生长变慢，荷瘤小鼠血清VEGF水平明显减低，荷瘤组织微血管密度明显降低。④通过筛选，我们观察到棉酚可同时降低乳腺癌细胞内MDM2和VEGF的表达，机制上是通过干预MDM2和VEGF mRNA之间结合、诱导MDM2自身泛素化降解、抑制VEGF翻译来实现该效应，并且棉酚可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成。⑤此外还发现MDM2/Akt通路相关的其他一些蛋白的异常表达，如MACC1和SPON2等，发现它们的表达与乳腺癌患者组织学分级、TNM 分期、淋巴结转移、Nottingham预后指数、肿瘤复发等显著相关，并对患者总生存期和无进展生存期有显著影响，提示MACC1 和 SPON2 可能参与了乳腺癌的发生、发展，在乳腺癌预后评估中具有一定价值，可能成为潜在的治疗靶点。