Hippo信号通路通过CD74调控小细胞肺癌多药耐药机制的研究

Our previous study indicated that Hippo pathway was associated with multidrug resistance(MDR) of small cell lung cancer(SCLC). Nevertheless, its functional role and underlying mechanisms remain unknown. In this study ,we will focus on the mechanism of Hippo pathway-regulated MDR of SCLC with the methods of cell biology technique, molecular biological technique and animal experiment. We will perform immunohistochemical staining to examine the protein expression of the core molecular in Hippo pathway, we will investigate the clinical features of expression of the core molecular in Hippo pathway. To investigate the biological roles of Hippo pathway in human SCLC, we developed YAP1 consistent actived cell and YAP1 consistent inhibited cell. Then we analysis the effect of YAP1 on the drug-sensitivity, apoptosis, proliferation with the methods of CCK-8, flow cytometry and western-blotting. We will also conduct tumour xenograft models to substantiate the effect of Hippo pathway on MDR in vivo . We will perform loss-of-function studies to further assess whether the role of Hippo pathway in MDR is mediated by CD74. At last, we will focus on the effect of CD74 on the MDR of SCLC. This study will provide a mechanism of MDR mediated by Hippo pathway through CD74, suggesting that Hippo pathway and CD74 may be candidate targets for developing therapeutic strategy to overcome MDR of SCLC.

我们前期研究发现Hippo通路可能参与小细胞肺癌（SCLC）多药耐药过程。而Hippo通路与SCLC关系研究较少。本课题拟在前期研究基础上采用分子生物学和细胞生物学、动物实验等方法来开展以下研究：1、研究Hippo通路核心分子在SCLC临床样本中的表达，以及其表达与预后、分期等关系；2、建立Hippo通路效应分子YAP1持续激活型和持续抑制型细胞，研究YAP1的激活和抑制对于SCLC药物敏感性、凋亡、增殖等指标的影响；3、通过裸鼠成瘤及体内药敏实验，研究Hippo通路在体内对于SCLC的作用；4、通过PCR、WB、ChIP等方法研究Hippo通路对于其可能下游基因CD74的作用；5、通过上、下调CD74，靶向MIF/CD74，研究CD74对于SCLC药物敏感性、凋亡影响，并寻找可能机制。通过本项研究，进一步丰富SCLC多药耐药的分子机制，确定Hippo通路、CD74对于SCLC的重要作用。

此前研究中我们发现Hippo信号通路可能对于小细胞肺癌（SCLC）的多药耐药具有一定的作用。而其对于SCLC的放疗抵抗及可能机制不明确。肿瘤微环境（TME）细胞是构成肿瘤组织的重要组分，它们在临床病理预后和治疗效果的预测上发挥着重要作用。而对于SCLC肿瘤微环境的系统研究极少。. 通过分析Hippo信号通路中重要蛋白MST2、pMST2、YAP1、pYAP1在SCLC临床样本中的表达及其与患者临床分期及预后的可能关系。比较Hippo信号通路核心分子YAP1与CD74、CD133的表达关系。在SCLC细胞系中建立YAP1持续激活及持续抑制的细胞系，通过CCK-8、流式细胞术、裸鼠体内药敏实验等研究YAP1对于SCLC多药耐药的影响及放疗敏感性的影响。而后通过靶向抑制CD74及流式分选CD133研究CD74对于SCLC多药耐药的影响及CD133对于SCLC放疗抵抗的影响。同时，我们利用GEO等数据库中基因表达数据，分析了SCLC TME中免疫细胞组分，构建基于TME的SCLC分子亚型，进一步评估分子亚型与预后及临床特征的关系。使用SCLC分子亚型间差异表达基因构建TME风险评分模型。进一步比较TME与基因组变异特征的关系。. 我们研究YAP1与SCLC临床分期及预后显著相关，而MST2、pMST2、pYAP1与SCLC临床分期及预后未见统计学差异。在临床样本及细胞系中，YAP1的表达与CD74、CD133表达显著相关。通过持续激活YAP1可以诱导SCLC多药耐药表型及放疗抵抗表型。持续抑制YAP1可以增加SCLC药物敏感性及放疗敏感性。通过抑制CD74，可以增加SCLC药物敏感性。而经过CD133流式分选后，CD133阳性表达细胞放疗敏感性显著降低。另外，通过对SCLC肿瘤微环境进行生信分析，构建了基于TME的SCLC分子亚型(TMEC1-3)，发现分子亚型与预后及临床特征显著相关。通过分子亚型间差异表达基因构建的TME风险评分模型能较好的对SCLC样本进行预后评估。此外还发现了一组与TME有重要关联的基因。. 通过上述研究，进一步丰富了SCLC多药耐药及放疗抵抗的机制。对于SCLC中YAP1高表达的患者可能具有潜在的临床意义。而通过对SCLC的TME特征综合景观的分析，可能有助于解释SCLC对免疫疗法的响应，为SCLC免疫治疗提供一种可能的参考。