用于高灵敏、可视化病毒检测的噬菌粒纳米探针研究

The limits of detection (LOD) of current technologies for visual detection of viruses such as colloidal gold test strip and ELISA, are about 5pM and 1fM, respectively. These technologies are unable to detect a sample with virus at aM concentation from an animal or human. We previously demonstrated an ultrasensitive naked-eye-counting strategy with a LOD of 3 aM by employing a phage-Au nanoparticle (GNP) probe that T7 phage is assembled with GNP in a “one-to-one” manner and a magnetical microparticle probe. Based on the previous work, we furthermore develop a ready-to-use, ultra-sensitive and visual method for detection of virus by constructing a short M13 phagemid with a length of about 100 nm and a diameter of 6nm. The capsid proteins at both ends of the recombinant rod-like phagemid are fused by gene engineering technology with a gold binding peptide and a target virus binding peptide, respectively. In addition, the recombinant phagemid genome contains a lacZα gene, which enables the recombinant phagemid develop into the blue monoclone plaque on the Xgal LB petri dish once mixed with host bacteria with lacZα mutant and plated on solid medium. Finally the phagemid nanoprobe can be obtained by mixing the recombinant phagemid with GNP and purifying by centrifugal washing. In the study, we will employ Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and vesicular stomatitis virus as the representative viruses to demonstrate the phagemid mediated ultra-sensitive and visual detection of virus by employing our phagemid nanoprobe and an anti-PRRSV antibody functionalized magnetic nanoparticle probe. Meanwhile the popular PCR technology will be employed to compare with our phagemid nanoprobe-based method on the sensitivity, specificity, reproducibility and stability. We aim to develop a new, ready-to-use, ultra-sensitive, visual method for detection of virus.

目前可视化检测病毒的技术灵敏度不够高，无法检测动物或人病毒感染早期极微量病毒样本。.申请人在成功构建了一种T7噬菌体金纳米探针的基础上，拟通过基因编辑M13噬菌体研究，获得一种长度约100nm直径6nm的含lacZα基因的重组噬菌粒（其一端衣壳蛋白融合金亲和肽，另一端融合特异识别目标病毒的多肽，lacZα基因赋予重组噬菌粒感染宿主形成肉眼可见蓝色单克隆噬菌斑的能力）。进一步研究此重组噬菌粒与金纳米粒子的组装，构建一种以金纳米粒子为核表面修饰许多重组噬菌粒的噬菌粒纳米探针。.此噬菌粒纳米探针，与抗目标病毒的抗体修饰的磁探针组成检测体系，检测细胞培养来源及临床样本中两种代表性病毒（蓝耳病病毒和水疱性口炎病毒），并用荧光定量PCR平行检测验证体系的特异性、灵敏度、重复性及符合率，最终发展一种基于噬菌粒纳米探针的超灵敏、可视化检测病毒的新技术。

病原的体外超灵敏检测一直是体外诊断领域的重要探索方向。目前病原体的检测，仍然依赖传统PCR技术及胶体金技术，没有突破性进展。体外诊断的核心是兼顾灵敏度和特异性的信号放大媒介或可视化策略。申请人在成功构建了一种T7噬菌体金纳米探针的基础上，初阶段拟在基因工程改造的M13噬菌体上进一步探索，整合目前已有的纳米生物技术，获得一种长度约100nm直径6nm的含lacZα基因的重组短噬菌粒，将其修饰于金纳米颗粒表层，利用磁探针辅助夹心捕获病毒后，分离洗脱金探针表面的噬菌体并在培养板上形成的噬菌斑来放大病毒检测的信号。在之后的研究过程中，我们发现基因改造M13丝状噬菌体成为短棒状的噬菌粒后，反复试验以大量收获短噬菌粒仍然不成功。因此我们转换了思路，通过多方面的探索总结为以下研究内容：1、基于纳米探针的镜下可视化检测：根据不同材质，不同尺寸的纳米探针进行生物修饰，物理及光学特性，探究其针对不同病原体的靶向结合能力，设计和证实其在暗场显微镜，扫描电镜等检测设备下的一些应用策略；2、基于纳米材料辅助的噬菌体探针检测策略：利用展示技术获得可高效靶向抗原分子的噬菌体颗粒，在磁纳米探针，金探针辅助捕获抗原后通过PCR，噬菌斑计数，SPR等技术手段放大信号；3、丝状噬菌体的长度及扩增效率机制的研究，批量构建功能性短噬菌体。目前，研究已获得的结果有：1）我们发现金/银纳米颗粒强等离子共振属性诱发的光学效应作为暗场探针的极佳特质，可以完成单颗粒镜下计数，我们完成了30nm-5μm不同尺寸大小的病原定量检测，在人工智能辅助技术下检测灵敏度最低可达到3copies/μl。2）我们构建出结合能力极好的M13噬菌体，其体部丰富的p8蛋白作为信号放大的基础，我们构建出数种基于噬菌体探针的超灵敏检测技术，完成了针对禽流感病毒及癌胚抗原的精确检测。3）我们发现截取丝状噬菌体基因间区内的有效复制原件，在具备辅助质粒（提供包装蛋白）的条件下，可以形成短棒状噬菌体颗粒。基于以上结果，后期可以进一步拓宽噬菌体纳米生物技术的研发方向，开发出全新的超灵敏的智能化检测系统。