酵母Mex67蛋白在mRNA 3’端剪切加尾修饰过程中的作用及机制研究

真核细胞mRNA的3'端剪切加尾过程和出核转运过程有着密切关联，但尚无研究表明出核转运因子是否对3'端修饰过程进行直接调控，申请人前期的研究发现酵母细胞中出核转运因子Mex67与3'端剪切加尾机器存在功能上的关联，而且预实验结果显示Mex67与剪切加尾蛋白Syc1在体外可特异性结合，提示Mex67对于mRNA　3'端修饰过程可能存在直接的调控作用，本项目拟运用Degron技术形成细胞内Mex67的降解，以研究Mex67功能的完全丧失对3'端修饰过程的影响，并运用基因中断技术等探讨Mex67是否通过与剪切加尾蛋白如Syc1的相互作用而影响3'端的修饰过程；项目还将运用串联亲和纯化技术探讨Mex67是否通过协助剪切加尾复合物的组装而影响3'端的修饰过程。本项目的研究结果将从新的角度探讨mRNA 3'端修饰过程的分子机制，为研究 mRNA　转录后修饰过程和出核转运之间的偶联提供新的证据和思路。

真核细胞新生成的mRNA 的3’端剪切加尾过程和出核转运过程有密切关联，但尚无研究表明胞核内协助mRNA进行出核转运的蛋白是否对3’端修饰过程进行直接调控，我们的前期研究发现酵母细胞出核转运因子Mex67与剪切加尾机器存在功能上的关联，提示Mex67对于mRNA3’端修饰过程可能存在直接的调控作用，本项目拟造成一定条件下Mex67蛋白的完全缺失，研究在该蛋白功能丧失的情况下对mRNA3’端剪切和/或加尾过程产生的影响及分子机制。在项目实施过程中，常规构建degron菌株的方法未能筛选出可存活的MEX67-degron菌株，我们设计构建了依赖于四环素启动子控制Mex67表达的单倍体菌株Tet-MEX67，这一菌株在四环素类药物的作用下能关闭MEX67基因的转录，从而达到在活细胞体内去除Mex67蛋白的目的，已用这一菌株成功进行了体外剪切加尾等实验，证明该菌株可在功能上完全替代MEX67-degron菌株，课题基本按原计划进行。结果发现在Mex67完全缺失的情况下，mRNA3’ 端仍能进行剪切加尾反应，但poly (A)尾的长度比正常对照明显增加；Northern blot 分析显示Mex67的缺失导致read through 转录子出现，提示Mex67的缺失降低了剪切加尾效率。在Mex67缺失时去除Syc1蛋白可使read through转录子的生成明显减少，提示Syc1与Mex67之间的相互作用参与了对3’端剪切加尾效率的调节。在体外剪切加尾反应实验中，我们首次运用非放射性同位素的方法检测到剪切加尾产物，目前还未见国内外文献中有类似报道，利用这一方法我们还发现一些参与调控剪切加尾过程的核内蛋白如Thp1,Sac3和Sus1等。已将TAP tag 与Tet-MEX67细胞的RNA15和PTA1基因进行整合，以表达C末端带有TAP 的Rna15或Pta1融合蛋白，目前正在用TAP方法纯化并分离剪切加尾机器的成分，探讨Mex67是否影响剪切加尾机器的组装。已构建酵母双杂交实验所需的质粒，正在进行酵母双杂交实验，检测能与Mex67进行相互作用的剪切加尾因子。本项目的研究已基本完成预期目标，发现出核转运因子Mex67可能通过与剪切加尾复合物的成分相互作用而参与调节mRNA的剪切加尾过程，为研究 mRNA转录后修饰过程和出核转运之间的耦联提供了新的证据。