植物乳杆菌中叶酸主要生物合成途径的分子调控机理

Folate, a chemical called pteroylglutamic acid, is water soluble form of vitamin B9. Mammalian cells can not synthesize folate by themselves, so once the inake of folate is too little, the body would be morbid corresponding folic acid deficiency. Folate widely exists in all kinds of food, however, the loss in cooking and storage process is high and folate deficiency is still a nutrition problem all around the world. Thus, it is very urgent and important to develop functional food rich in folate. There were more than 80 Lactobacillus plantarum strains in our laboratory which were isolated from traditional fermented food in Yunnan province and parts of these strains had the ability of high yield folate producing. Therefore, this project aims to clarify the molecular regulatory mechanism in different Lb. plantarum strains using the combination of comparative genomics, transcriptomics and metabolic products analysis, as well as the targeted gene knockout technology. We also want to analyze and illustrate the correlation between genetic diversity in key enzymes of folate major biosynthesis and the yield of folate, and build the fermentation model.

叶酸，化学名为蝶酰单谷氨酸，是维生素B9的水溶性形态。由于哺乳动物细胞自身不能合成该微量营养素，只能通过食物摄取获得，因此一旦所摄取叶酸过少，即会引起机体发生相应的叶酸缺乏性疾病。它广泛存在于各类食物中，但是在烹饪和保存过程中损失率较高；同时叶酸缺乏症仍然是一大世界性营养问题，因此开发富含叶酸的功能性食品极为迫切与重要。本实验室从云南传统发酵食品中分离并保存80余株植物乳杆菌菌株，发现其中部分菌株具有高产叶酸能力，因此，本项目拟结合比较基因组学、转录组学和主要代谢产物分析，并利用靶向基因敲除技术，深入阐明不同近亲种植物乳杆菌的叶酸主要生物合成途径的分子调控机理的异同；分析与阐明叶酸主要生物合成途径中关键酶基因在不同植物乳杆菌菌株间的基因多态性与叶酸产量的相关性，并由此建立植物乳杆菌的叶酸生物发酵模型。

叶酸是细胞代谢的重要中间体，由于缺乏叶酸生物合成途径中的关键酶，人类需要从膳食中摄取叶酸。由于谷氨酸尾部的结构差异，生物合成的叶酸要优于化学合成的叶酸。微生物和植物能够产生叶酸，其中，植物乳杆菌能够利用不同的发酵基质改变叶酸含量，因此本研究对植物乳杆菌叶酸合成途径分子调控机理进行研究。.本研究从传统发酵食品中分离得到26株植物乳杆菌，加上课题组菌种库中已有的41株植物乳杆菌，共计67株植物乳杆菌，均为具有合成叶酸能力的植物乳杆菌。结合细菌热休克蛋白的dnaK基因鉴定67株菌株植物乳杆菌属于3个近亲种，分别为Lactobacillus.paraplantarum、Lb.pentosus和Lb.plantarum subsp.plantarum。选取8株分属不同近亲种的植物乳杆菌，针对叶酸合成6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸（6-hydroxymethyldihydropterin pyrophosphate，DHPPP）途径中的fol B，fol E，fol K，fol P和fol Q基因进行基因多态性研究，结果发现，fol B，fol E和fol K基因具有较高同源性，存在1处SNP位点为同义替换；fol P基因存在的14处SNP位点中，仅1处发生非同义替换；fol Q基因存在7处SNP位点，其中5处为非同义替换。通过构建合成途径中关键酶基因fol E、fol K、fol P、fol B及fol Q的基因敲除株及过表达菌株测定叶酸含量发现，敲除fol E、fol P、fol Q基因，菌株仍能够产生叶酸，结合YML4-3菌株基因组草图分析，找到Xtp1基因产物为fol Q基因同工酶。通过对Δfol P菌株形态学观察，证实fol P基因可能与细胞壁合成有关。转录组测序结果分析可知，对于植物乳杆菌体内叶酸合成途径，对氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，pABA）途径相关基因的表达也影响叶酸产量。最后，运用不同发酵基质培养不同植物乳杆菌菌株来合成叶酸，使用豆浆为发酵基质控制pH在6.0时，叶酸含量最高，这为以后开发发酵叶酸食品提供依据。