基于Leptin和IGF-1调控的山羊哺乳期发情机理研究

A serious shortfall of mutton production comes out with the improvement of national living standards.Implementation of goat lactation rutting can shorten kidding interval and improve the efficiency of mutton production.The hormones environment in lactating goats inhibiting follicular developing, this leads to no theoretical basis existed can be used to explain the goats rutting in lactation which existed in the population of Shanbei white cashmere goat. This project intends to study the molecular mechanisms regulating lactation estrus throughparsing the stimulating factors and its action model of goat postpartum oestru. Choosing the lactation estrus goats and estrus goats as experimental material, through determination of the change of hormone and blood content to ensure the activating factor of goat rutting in lactation;Ovarian tissue transcriptome sequencing and bioinformatics analysis will be carried out to pick out differentially expressed genes and its related signaling pathways;Buildingtarget genes’ vector and transfectedinto the ovarian cells toidentify the functions of the gene, confirming the interaction of the moleculars through QPCR and Western Blot, IP, ChIP and dual luciferase report system, then analyzing the regulation mechanism of lactating heat in goats. This study own the capacity of enriching the existing animal heat theory, supplying theoretical basis for developing nursing intervention of goats lactation estrus and improving the efficiency of goat production.

随着国民生活水平的提高，我国羊肉产能出现了严重不足。实现山羊的哺乳期发情，缩短山羊产羔间隔是提高羊肉生产效率的主要方向。但由于哺乳期山羊体内的激素环境抑制卵泡发育，所以生产中山羊的哺乳期发情尚无可解释的理论依据。本研究拟通过对调控哺乳期山羊发情的刺激因素及作用分子进行研究，以解析绒山羊哺乳期发情的分子机理。以绒山羊种群中哺乳期发情羊与不发情羊作为试验材料，对其血液中激素含量变化及血液成分的测定找出刺激山羊哺乳期发情的激活因子；对卵巢组织转录组测序、生物信息学分析差异表达基因并注释到信号通路以找出激活因子刺激山羊发情的可能的调控机理；构建关键差异基因载体并转染卵巢细胞，QPCR、Western Blot及流式细胞术等确定其功能；通过IP、ChIP及双荧光素酶载体等确认分子间互作关系，以解析山羊哺乳期发情的调控机制。本研究结果有望丰富和发展现有的动物发情的理论，为提高山羊生产效率提供理论依据。

山羊是我国非常重要的家养动物之一，对国民生产生活意义非常重大，然而，山羊的繁殖效率成为困扰山羊产业发展的重要因素之一。本研究以陕北白绒山羊作为研究对象，通过对分娩后的绒山羊母羊进行激素浓度测定找出调控山羊哺乳期发情的关键激素分子，对哺乳期发情及不发情羊只的卵巢进行转录组测序，找出与卵母细胞发育、增殖等相关的基因及非编码RNA。定量PCR验证转录组测序基因表达量。体外克隆差异基因及非编码 RNA 构建载体，定量PCR及Western等方法检测相关靶基因的表达及细胞活力，从而确定差异基因的功能。对靶基因位点突变与山羊繁殖性状之间的关系进行分析以证实其效果。结果表明，陕北白绒山羊群体中存在28.5%的个体具有哺乳期发情的能力，孕激素、促乳素和促性腺激素释放激素在发情前具有比较明显的变化，可能对山羊哺乳期发情具有重要的调控作用。 通过对哺乳期发情和不发情的山羊卵巢组织测序分析，筛选到4760个lncRNA和1970个差异表达mRNA，进一步分析mTOR、VEGF等通路与哺乳期发情相关。 利用 RACE 技术克隆候选调控分子lncRNA3059的全长片段，该lncRNA包含两个外显子，总长为563 nt，在山羊小卵泡、大卵泡及黄体中的表达量逐级降低（P < 0.05）。将lncRNA3059 过表达载体转染至 CHO-K1 细胞后，通过 qRT-PCR、Western blotting等检测方法对细胞增殖能力进行鉴定，发现过表达组细胞的增殖标志基因CDK4、PCNA及CCND1在mRNA 水平上的表达均显著升高（P < 0.05），说明lncRNA3059能够促进细胞的增殖过程。靶基因GDF9 基因上的 3 个突变位点（Q320P、V397I 及 3’调控区存在 12-bp indel 新型突变）与产羔数性状具有显著相关性（P < 0.05），且 Q320P 及 indel突变位点较 V397I 位点显示出更加稳定的影响。同时，Q320P 与 V397I 位点在绒山羊大群体中处于强连锁不平衡状态（D’= 1.000，r2 = 0.351）。综上，本研究的开展，解析了调控山羊哺乳期发情的激素因素及分析因素，并找出了影响山羊哺乳期发情的关键分子。为山羊哺乳期发情机制的进一步研究提供了方向，为加快山羊品系选育提供了分子基础。