KCTD10通过VEGF信号通路影响内皮间质转化对心脏瓣膜形成的调控机制研究

The cellular process of Endothelial-mesenchymal transition (EMT) in the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) are critical events in development of the heart valve；NFATc1, HIF1 affects the EMT by regulating VEGF signaling. Previously, we found that KCTD10 knockout mice show severe defects in atrioventricular valve development, the EMT process at E9.5 and E10.5 were repressed; knockdown of KCTD10 in HUVEC cells cause down-regulation of downstream target genes of EMT such as β-Catenin and α-SMA, decrease of NFATc1, and increases of HIF1α and VEGF; KCTD10 could bind to NFATc1 or HIF1β which positively regulates NFATc1 and negatively regulates HIF1α and HIF1β, respectively. Thus, it is supposed that KCTD10 may regulate the heart valve formation by affecting the process of EMT via VEGF signaling. In this study, we will create mice lines with KCTD10 knockout specifically in endocardiac cells or myocardiac cells; using these mice lines, we will analyze the role of KCTD10 in heart valve development, in the process of EMT and VEGF signaling regulation; we will further check in vitro how KCTD10 knockout affects the EMT process of mice embryonic endocardiac cushion, the function of endocardiac cells, and investigate the underlying molecular mechanism; we are also going to discover the clinical relevance between KCTD10 mutation and valvular heart diseases.

房室管和流出道内皮间质转化（EMT）是心脏瓣膜形成的关键步骤；HIF1、NFATc1可通过调控VEGF影响EMT过程。我们前期发现：KCTD10敲除小鼠胚胎产生房室瓣缺陷等发育障碍，E9.5和E10.5房室管EMT受到抑制；脐静脉内皮细胞中敲低KCTD10后EMT下游基因β-Catenin和α-SMA表达下调，NFATc1表达减少、HIF1α和VEGF表达增加；KCTD10可结合HIF1β、NFATc1，正调控NFATc1、负调控HIF1α和HIF1β。因此推测KCTD10通过VEGF影响EMT过程而调节心脏瓣膜发育。本研究拟建立内皮细胞、心肌细胞特异剔除KCTD10小鼠，分析KCTD10在心脏瓣膜发育、EMT和VEGF相关通路调节中的作用，利用体外实验进一步分析KCTD10对小鼠胚胎心内膜垫EMT能力、内皮细胞功能的影响及分子机制，研究KCTD10突变与心脏瓣膜病的临床相关性。

血管生成由血管生成因子和抗血管生成因子之间的动态平衡所调节。缺氧、炎症和缺血等环境也可刺激新生血管生成。病理性视网膜血管生成是视力削弱的主要原因，抗血管内皮生长因子疗法提高了视网膜新生血管的管理，但是一些病人无应答。更多参与视网膜生理病理过程的血管调节因子需要作为抗血管靶点发展新的治疗和保护病人视力。.我们首次克隆了大鼠KCTD10基因，发现KCTD10 在进化上高度保守，其N 端和C 端分别具有保守的BTB/POZ 结构域和增殖细胞核抗原（PCNA）结合结构域，并证实了KCTD10 能够与PCNA 和DNA 聚合酶δ 相互作用；而且，原位杂交表明KCTD10 基因在心脏、肺和精子中表达较高，提示KCTD10 在心脏和肺等组织发挥重要功能。我们于2008 年建立了KCTD10 基因敲除的小鼠模型，2014年发表的研究结果发现KCTD10 基因敲除小鼠表现出严重的心脏AVC 瓣膜缺陷和血管形成抑制，第10.5 天的胚胎（E10.5）致死；而斑马鱼中KCTD10 的缺失也导致了严重的心包水肿和心脏形成缺陷。先天性心脏病是最普遍的出生缺陷类型，Down 综合症一般有大量的心内膜垫缺损，有研究通过基于稀疏表示的变量选择算法（SRVS）和RNA 芯片方法对比分析了21例有CHD 和22 例无CHD 的Down 综合症患者细胞中167 种CHD 候选基因，发现KCTD10 为重要的CHD 相关基因。miR-592下调负调控KCTD10而抑制Notch信号通路可阻碍CHD。因此，KCTD10 对于心脏瓣膜和血管发育至关重要。.Kctd10在视网膜血管系统中的特异性功能是不清楚的。在这个课题中我们在视网膜中产生了Kctd10特异性敲除小鼠研究Kctd10在视网膜血管生成中的作用及其机制。我们发现Kctd10在视网膜中的敲除降低了小鼠p25, p45, p90, p180中GCL、INL、ONL层细胞数目，ERG检测到视力功能的缺陷。Kctd10的敲除特异性提高了视网膜中Robo4的表达。其机制是Kctd10促进了Robo4的泛素化和降解，而Kctd10的敲除提高了Robo4的稳定性。Robo4抗体挽救了Kctd10敲除模型的功能缺陷。而且，Kctd10敲除通过抑制了小鼠CNV和OIR模型中病理性血管生成也稳定了血管网络。因此Kctd10阻断可能有效地抑制视网膜病理性疾病中血管生成。