水稻OsCAS（Calcium-sensing Receptor）基因的功能分析

Ca2+是生物体主要的营养物质，也是逆境应答途径中重要的信号分子。在拟南芥中首次鉴定的胞外Ca2+敏感受体CAS，揭示了植物如何感受外界钙信号并引起细胞级联生理反应的机制，证明植物中Ca2+也可以发挥第一信使的作用。在此基础上，我们克隆分离了重要农作物水稻的OsCas基因。证明OsCAS是定位在质膜上胞外Ca2+敏感受体，并获得了该基因过表达和RNAi的株系。转基因植株出现不育、茎秆黄斑、矮化等表型变化，抗逆性也发生了改变，提示该基因具有重要的生物学功能。本项目将针对转基因后代突变性状进行研究，先确认变异的原因，然后对转基因植株进行逆境胁迫，再研究突变株钙离子活体成像的变化以及对逆境的响应，揭示胞内、外钙离子如何通过OsCAS协同调节水稻应对逆境信号的变化，同时理解这一协同变化如何调节水稻生长发育的过程，为提高水稻抗逆性研究奠定理论基础。

本项目主要针对水稻OsCAS基因的功能展开研究。序列分析结果表明，OsCAS基因与拟南芥CAS有很高的相似性，转化HEK293动物细胞系结果证明了OsCAS为细胞外Ca2+受体。农杆菌介导法转化水稻获得OsCAS高表达（777）和RNAi株系（766），利用荧光定量PCR方法分析了OsCAS基因在不同株系、同一植株不同部位以及不同生长时期（苗期、分蘖期、孕穗期和成熟期）、不同钙离子浓度处理的幼苗OsCAS基因的的表达水平。实验结果显示，叶片中OsCAS基因的表达量最高，而根中的表达量最低，接近于没有表达，这与OsCAS基因定位于类囊体上的实验结果一致；而不同生长时期水稻叶片的荧光定量PCR结果显示，OsCAS在苗期和分蘖期的表达量相对较高，孕穗期明显下降；同时在不同浓度钙离子营养液处理水稻幼苗后，随着钙离子浓度的升高，OsCAS基因的表达有小幅度的升高，差异并不明显。以野生型日本晴水稻为实验材料，在水培的条件下，采用PEG6000模拟干旱处理的方法研究外源钙离子对干旱胁迫下野生型水稻生理活性的影响，以探讨Ca2+对于干旱胁迫的作用及其机理。干旱处理后，植物体内发生了一系列的变化来提高对自身的保护作用。实验结果显示，在培养液中加入适当的钙离子有助于提高水稻对不同程度干旱胁迫的耐受性。同时对WT和777株系分蘖期的抗旱生理生化指标进行了比较分析，测定了CAT、POD和SOD活性及MDA和Pro含量。结果表明777在分蘖期较WT对干旱有较强的抗性，特别是在严重干旱时优势尤为明显。以往研究结果证实拟南芥CAS定位在叶绿体类囊体膜上，并且拟南芥和水稻的CAS在C-末端都含有一个保守的硫氰酸酶结构域。硫氰酸酶构域主要是一种光调节蛋白，对于光照强度具有很高的响应, 推测CAS的表达量与光调节的强度和磷酸化水平具有很高的相关性。因此我们对Ca2+与PEG共同作用下转OsCAS基因水稻叶绿素荧光参数进行了分析。叶绿素荧光结果表明钙离子通过调节777株系的PS II反应中的量子产量与活性，能够部分缓解干旱胁迫对其产生的影响，相反766与野生型株系则在干旱胁迫的情况下加入钙离子并不能缓解PS II反应中心的关闭与失活现象。综上所述，OsCAS基因高表达株系对干旱胁迫有较好的耐受性，特别是加入Ca2+后表而胞内Ca2+激发了逆境胁迫应答反应，从而提高了OsCAS基因高表达株系的抗旱能力。