黄芪丹参配伍提取物对心肌梗死后心室重构中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信号转导通路影响的研究

研究假设：PKD通过调控心脏组织AP-1/C-Jun-MMPs信号通路促进心肌肥厚，从而导致心肌梗死后左室重构的发生；中药黄芪和丹参配伍提取物通过调控这一信号通路从而逆转心肌梗死后左室重构。研究思路：采用大孔树脂吸附等技术分离提取黄芪和丹参有效成分，筛选出最佳配伍组合；分别从体外心肌成纤维细胞培养水平和构建心肌梗死大鼠模型的整体水平上观察研究和分析黄芪丹参配伍提取物作用下PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信号通路中关键分子的相关性及其表达水平变化，从信号机制角度深入探讨黄芪丹参抗心肌梗死后心室重构的分子机理，为益气活血类中药在临床上准确而有效的防治心脑血管等疾病提供科学依据。

81173372课题已进行实验研究包含四部分内容：（一）黄芪、丹参配伍提取物的分离纯化：以黄芪、丹参为研究对象，采用大孔树脂吸附进行分离纯化黄芪、丹参的有效化学部位，分离出的黄芪总皂苷纯度是66.9%，丹参总酚酸的纯度是63.7%。（二）大鼠乳鼠心肌成纤维细胞（CFs）的体外培养以及黄芪丹参配伍提取物最佳配伍组合的筛选：对CFs进行分离培养，加入10-6mol•L-1血管紧张素II（AngII）进行增殖诱导，再分别加入浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/ml的黄芪和丹参配伍提取物（1:1配伍）进行干预，用以筛选黄芪丹参提取物的最佳配伍组合，结果显示1μg/ml(10-3g•L-1)以上剂量组黄芪丹参提取物配伍具有明显抑制AngII诱导的大鼠乳鼠CFs增殖的作用。接下来的研究中，使用流式细胞仪（FCM）分别测定了10-3g•L-1的黄芪提取物、丹参提取物单体以及黄芪丹参提取物配伍组合对CFs周期的影响，结果表明10-3g•L-1的黄芪提取物、丹参提取物、黄芪丹参配伍提取物均可明显抑制AngII诱导的心肌成纤维细胞的增殖，较之单体，黄芪丹参提取物配伍组合抑制作用更加显著。（三）丹参提取物对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的影响及PKD1 mRNA的表达分析：在培养CFs的过程中，我们也做了心肌细胞的培养，应用AngII诱导复制出乳鼠肥大心肌细胞肥大模型，加入10-4，10-3，10-2 g•L-1的丹参提取物进行干预，并对心肌细胞的数量、直径以及蛋白含量进行了检测，同时进行了乳鼠肥大心肌细胞中PKD1 mRNA的表达分析。结果表明10-3，10-2 g•L-1的丹参提取物可以明显减小心肌细胞直径，降低心肌细胞总的蛋白表达含量，而这一过程伴随着肥大心肌细胞PKD1 mRNA表达的下降。（四）整体动物实验-黄芪和丹参提取物配伍对大鼠心肌梗死后心肌组织病理变化的影响及与PKD1表达的关系：构建大鼠心肌梗死模型，分别使用黄芪、丹参及黄芪丹参配伍按20 mg•(kg•d)-1对大鼠灌胃，8周后测定大鼠的血流动力学变化；应用HE染色分析左心室心肌细胞组织形态学变化；采用Masson染色法检测左心室心肌胶原纤维；应用免疫组化法检测左心室心肌组织蛋白激酶D1(PKD1)的表达情况。结果表明，黄芪丹参配伍可明显改善心肌