乳酸菌H+-ATPase活力的分子调控机制

针对酸奶"后酸化"这一乳品加工行业的关键技术瓶颈，基于已经获得的"后酸化"弱的突变菌株，借助Western blot、DNA测序、RT-PCR和荧光定量PCR试验等现代分子生物学和免疫学手段，研究亲本菌株与突变菌株的H+-ATPase编码基因和转录调控基因的同源性、蛋白表达量和转录水平上的差异、突变菌株的遗传稳定性及其弱后酸化发酵剂的应用。阐明乳酸菌H+-ATPase活力的分子调控机制；从而实现对乳酸菌酸耐受性的调控，以期获得具有强耐酸性的益生菌菌株或者酸敏感的弱后酸化酸奶发酵剂菌株。其意义在于通过调控乳酸菌的H+-ATPase活力来增强或降低乳酸菌的酸耐受性，为筛选和构建酸敏感的酸奶用发酵剂菌株和酸耐受性强的益生菌菌株提供理论依据和技术支持。延缓酸奶的后酸化，缩小国内与国外在这一领域的技术差距，提高国内乳品加工企业的技术竞争力。

“后酸化”问题一直是制约酸奶产品品质和货架期的关键因素，德氏乳杆菌保加利亚亚种的H+-ATPase是导致酸奶发生后酸化的主要原因，本试验对具有弱后酸化能力的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株的H+-ATPase活力调控机制和应用进行了研究，不但为筛选酸敏感的发酵剂菌株提供理论依据和技术支持，而且研制的弱后酸化酸奶发酵剂能够显著延缓酸奶后酸化，具有非常重要的意义。本课题共设计了六个试验，包括质膜H+-ATPase活性与蛋白表达量之间的关系、亲本和突变菌株的H+-ATPase编码基因和调控基因同源性比较、亲本和突变菌株H+-ATPase表达的比较、突变菌株遗传稳定性试验、弱后酸化直投式酸奶发酵剂的研制。利用磷钼蓝比色法来测定质膜H+-ATPase的活力，结果表明，KLDS 1.9201-11的质膜H+-ATPase活力为KLDS 1.9201的59%，后续的Western blot分析进一步验证了这个结果。PCR扩增KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的H+-ATPase的编码基因和调控基因并测序，测序结果表明，KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的H+-ATPase的编码基因和调控基因的同源性为100%。利用实时荧光定量PCR来测定KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11中质膜H+-ATPase的表达，结果表明，KLDS 1.9201的H+-ATPase的表达量是KLDS 1.9201-11的3.03倍。在MRS液体培养基中连续传代培养时，形态学观察、代谢产物分析、RAPD分析和全细胞蛋白电泳分析结果表明KLDS1.9201-11能够稳定遗传至第8代，可用于弱后酸化酸奶发酵剂的研制。通过正交试验优化确定了混菌增殖培养基组成为6%乳清、3%脱脂乳粉、5.0%番茄汁和1.0%酵母粉；培养条件为，L.b：S.t=2:1，初始pH为6.2，在42℃下培养至稳定期初期；随后在4℃下，6000 r/min离心15min收集菌体后冻干，冻干保护剂配方为脱脂乳8%、甘油2%、海藻糖2%、L-谷氨酸2%。感官评定结果表明使用KLDS1.9201-11制备的酸奶样品的口感、组织状态和气味等同Rhodia 900发酵剂制备的酸奶样品没有明显差异。贮存实验结果表明，利用此发酵剂制作的酸奶的后酸化程度显著降低。