介入微循环调控骨再生微环境促进CXCR4修饰的BMSCs修复大段骨缺损研究

大块骨缺损的缺血损伤微环境抑制种子细胞存活、增殖分化和合理分布，极大限制组织工程骨（TEB）的成骨能力。我们前期建立可调控的体内灌注诱导成骨微环境系统（ROIMS），能明显促进TEB成骨，但也出现瘢痕化、BMP-2诱导异位骨化和关节僵硬等问题。本课题建立介入微循环系统（IMCS）：①通过灌注营养并排除废物来改善缺血损伤微环境，②利用膜引导系统构建无瘢痕化的安全诱导成骨微环境，③动态补充BMSCs，通过SDF-1介导CXCR4修饰的BMSCs向骨形成部位归巢，并促进其增殖、定向分布与分化来再生修复大段骨缺损。通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、共聚焦显微镜等观察IMCS对BMSCs的迁移、增殖、分化及成骨的影响并分析其相关性，通过X线、Micro-CT观察骨塑形过程，通过力学性能测试来评估其功能修复效果，对揭示大段骨缺损的原位再生修复机制具有重要意义，也为临床大段骨缺损的治疗提供新思路。

项目的背景：我们前期已构建了可调控的体内灌注诱导成骨微环境系统（ROIMS），对山羊胫骨大段骨缺损进行修复，将营养和BMP-2灌注到骨缺损部位，能明显改善组织工程骨（TEB）的成骨能力，但BMP-2流失到周围组织可导致异位骨化、关节僵硬等副作用，而且纤维组织侵入性生长导致瘢痕化愈合，均限制了大段骨缺损的功能重建。.主要研究内容：（1）本项目新增排出功能并利用SDF-1引导膜构建介入微循环系统(IMCS) ，拟通过排出通道将代谢废物和损伤因素排除以改善损伤微环境，建立含有种子细胞及诱导因子的再生微环境，（2）拟通过膜阻止纤维组织侵入避免瘢痕化，防止BMP-2流失到周围组织导致异位骨化甚至关节僵硬，（3）经IMCS循环通道将CXCR4+—BMSCs和BMP-2泵入损伤区，促进种子细胞的增殖与定向分化与分布，（4）检测山羊TEB组织样本中碱性磷酸酶(ALP)、核心结合因子 a 1( cbfa 1)、骨钙素(OC)、 转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA 表达的变化探讨可能的分子机制，（5）利用X线、3D-CT以及观察患肢运动能力恢复情况来评估山羊胫骨大段骨缺损的再生修复及功能重建效果。.重要结果：（1）IMCS可将BMSCs、诱导因子、细胞培养基泵入损伤区，同时成功将损伤局部产生的代谢废物、细胞毒性产物排出体外；（2）通过引导膜将BMP-2局限在骨缺损局部，提高BMP-2利用效率，避免异位骨化、关节僵硬等副作用；（3）IMCS通过引导膜将纤维组织隔离在再生组织之外，新生组织中均未观察到纤维组织存在，表明IMCS为骨再生提供了一个无瘢痕化的再生微环境；（4）SDF-1引导膜，吸引CXCR4+—BMSCs定向分布在骨形成部位，加速髓腔再通、皮质骨形成；（5）标本中未检测出ALP基因信号的表达，产物为非特异性扩增，提示成骨细胞成熟期，而Cbfa1 、OC、TGF-β1含量比正常骨组织增加，说明本实验能够明显促进成骨（p<0.05）；（6）术后两个半月时可见山羊胫骨断端骨痂连续，髓腔与皮质骨重塑，两断端被快速“焊接，山羊站立、行走及奔跑功能完全恢复正常。.科学意义：应用IMCS重建组织器官的原位再生修复微环境，实现快速的形态修复与功能重建，“介入微循环”这一新的学说将丰富组织器官的原位再生修复理论，有望为干细胞移植、组织工程化组织器官走向临床应用开辟新的途径。.