新细胞粘附分子CADM2抑制肿瘤转移的分子机制研究

细胞粘附分子与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。其中CADMs（cell adhesion molecules）亚家族具有3个Ig样结构域、单次跨膜区、蛋白4.1结合域和II型PDZ结构域的结构特征，在肿瘤中的作用越来越受到重视。在前期研究中我们通过甲基化敏感性代表性差异分析（MS-RDA）方法筛选到其中一成员CADM2基因存在超甲基化，进而发现CADM2基因在肝癌中表达下调，并初步证实其具有体外抑制肝癌细胞侵袭力的作用。本课题将进一步检测肝癌细胞和组织标本中CADM2的表达和甲基化水平及其与肿瘤临床分级分期和预后之间的联系；体内外实验深入且系统地研究该分子的结构与功能，确定与CADM2相互作用的功能性蛋白，阐明CADM2基因在肝癌中的作用和机制，为肝癌等肿瘤的靶向治疗和临床的预后判断等提供新靶点。

CADMs（Cell Adherin Molecules）家族属于免疫球蛋白超家族，目前发现由4个成员组成。其中CADM2的表达与功能越来越受到学者们的关注。在本项目中，我们通过半定量PCR方法检测CADM2在多种肿瘤细胞系中的mRNA表达水平。构建携带CADM2基因的慢病毒表达系统，感染CADM2低表达的HONE1和HNE1细胞，再通过细胞倍增、EdU掺入实验、克隆形成实验、非锚着依赖性生长实验等分析CADM2基因的过表达对肿瘤细胞的增殖能力和克隆形成能力的影响，进一步通过裸鼠体内成瘤实验验证CADM2对肿瘤细胞的体内成瘤能力的影响。为便于检测临床组织标本中CADM2的表达，制备了抗CADM2的特异性鼠单克隆抗体。采用流式细胞术检测CADM2对细胞周期的影响，通过Western blot和细胞免疫荧光等实验检测相关分子的表达。构建CADM2的多个结构缺失体，明确其发挥作用的相关结构域。最后通过免疫组化方法检测CADM2与细胞周期相关蛋白p-Akt、p27KIP1和p21WAF1/CIP1在临床组织标本中的表达情况，分析其表达相关性。.通过本课题的研究，我们发现CADM2在多种肿瘤细胞系中表达下调。在HONE1和HNE1细胞中，发现过表达CADM2可延长细胞的倍增时间，抑制细胞增殖、克隆形成、非锚着依赖性生长及裸鼠体内成瘤等能力。在机制研究中我们采用流式细胞术检测，发现CADM2可介导肿瘤细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞。通过Western blot检测发现CADM2可抑制p-Akt的活性，上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27KIP1和p21WAF1/CIP1的表达，下调细胞周期进展因子CDK2、CyclinE、Skp2的表达，最终发挥细胞周期阻滞的作用。通过CADM2缺失体研究我们还发现CADM2的细胞膜定位依赖于其胞外段，从而发挥其细胞周期阻滞作用。最后通过IHC检测临床肿瘤组织标本，发现肿瘤组织中存在CADM2的表达下调，与p-Akt表达呈负相关，与p27KIP1和p21WAF1/CIP1表达及细胞核定位有关，预示着CADM2的表达在肿瘤发生发展中具有重要作用。.我们的结果发现CADM2在肿瘤中呈表达下调或缺失，参与调节PI3K/Akt/p27KIP1、p21WAF1/CIP1介导肿瘤细胞发生周期阻滞，从而抑制肿瘤生长和转移，揭示了一种新的肿瘤发生发展机制。