IRES介导的Bmi1翻译调控机制及其结合的反式作用因子（ITAFs）对鼻咽癌发生和转移的影响

Nasopharyngeal carcinoma (NPC), is one of the leading malignancy in southern China and southeast Asia. Bmi-1, which immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells, is overexpressed in NPC and its.upregulation strongly correlates with an invasive phenotype and poor prognosis in patients with NPC. Therefore, it is urgent to explore the molecular mechanism of Bmi1 expression in NPC. We found that the mRNA and protein levels of Bmi1 were not completely concordant, indicating that Bmi1 may be post-transcriptionally regulated. Bioinformatic analysis shows that there are two internal ribosome entry sites in the 5’-UTR of Bmi1. The translational activity of the 5’-UTR is abolished after mutation of this two IRES elements, suggesting that the IRES elements may regulate the translation initiation of Bmi1. However, the IRES-trans-acting factors (ITAFs) responsible for the cap-independent translation of Bmi1 remain to be investigated. In the present study, we plan to identify ITAFs by RNA affinity binding proteins and mass spectrometry. We then analyze the roles of ITAFs in the translational regulation of Bmi1 and how ITAFs/Bmi1 pathway affect the tumorigenesis and progression of NPC. These results would provide molecular evidence to explore new therapeutic target for NPC.

癌基因Bmi1在鼻咽癌中高表达，可永生化正常鼻咽上皮细胞，促进肿瘤转移，并与鼻咽癌进展及较差的预后显著相关，但其在鼻咽癌中异常表达的分子机制尚不清楚。我们发现：在多种肿瘤细胞株中，Bmi1的mRNA和蛋白表达水平不一致；生物信息学分析发现：Bmi1 5平不一致；存在2个保守的IRES结构。将IRES基序突变后，5序突变后，的翻译活性显著下调，提示：IRES可在翻译水平调控Bmi1表达，但与IRES结合的反式作用因子(ITAFs)尚不清楚。本项目拟采用RNA亲和沉淀结合蛋白技术和质谱分析寻找与Bmi1-IRES基序结合的ITAFs；研究ITAFs对Bmi1翻译调控、正常鼻咽上皮细胞永生化和转移的影响，并在临床肿瘤标本中检测ITAFs的表达水平，分析其临床意义及与Bmi1的相关性。研究结果将阐明IRES介导的Bmi1翻译调控机制及其结合的ITAFs/ Bmi1调控网络对肿瘤发生与转移的影响，为临床防治鼻咽癌等恶性肿瘤提供新的靶标。

Bmi1是公认的癌基因，在鼻咽癌、乳腺癌和肝癌等多种肿瘤中高表达，能够诱导正常上皮细胞永生化，促进鼻咽癌、乳腺癌和肝癌上皮细胞侵袭迁移，其高表达和病人预后负相关。但其在肿瘤中异常表达的分子机制尚不清楚。我们发现，在鼻咽癌和乳腺癌肿瘤细胞株中，Bmi1的mRNA和蛋白表达水平不一致；推测Bmi1表达可能与BMI1 5’-UTR IRES翻译水平调控相关，合成已报到的真核细胞IRES结合ITAFs蛋白, 和调控病毒IRES相关ITAFs蛋白干扰文库，共干扰28个ITAFs蛋白。发现SRp20基因可能是潜在调控Bmi1的关键ITAFs蛋白，SRp20是否通过BMI1通路促进肿瘤细胞侵袭和转移有待进一步研究。Sp1和c-myc是调控Bmi1表达的关键转录因子，本项目通过ChIP分析表明Sp1/Sp3和c-myc都能与Bmi1基因的启动子核心区域结合，运用免疫共沉淀技术发现c-myc能与Sp1/Sp3形成转录复合物，是潜在协同参与调控Bmi1的转录调控的分子；在CNE2细胞中过表达Sp1/Sp3或c-myc后，Bmi1的表达上调，利用RNAi干扰技术抑制内源Sp1/Sp3或c-myc的表达后，Bmi1的表达下调，这些结果提示Sp1/Sp3和c-myc是协同调控Bmi1表达的关键因子；为了进一步探讨Sp1/Sp3/c-myc-Bmi1通路对鼻咽癌发生及转移的影响，我们采用Western Blot和免疫荧光检测EMT分子标记的表达与分布情况，划痕修复及Transwell侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力等试验，发现CNE2细胞中同时敲低Sp1/Sp3后，能显著上调上皮细胞的标记蛋白E-Cadherin和a-catenin的表达，并能促进E-Cadherin的膜定位，下调间质细胞的标记蛋白N-cadherin和Vimentin的表达；并且细胞的迁移及侵袭能力显著下调。通过转录组测序发现TACC3在肝癌组织中高表达，并且与肝癌细胞分化程度和预后显著相关，敲低TACC3抑制Bmi1表达和肝癌干细胞特性；同时，通过病人的生化指标分析，我们发现LDH与肝癌病人的预后相关。本研究提示SRp20和TACC3可能通过调控Bmi1表达来促进肿瘤的侵袭转移，为临床防治鼻咽癌、乳腺癌和肝癌等恶性肿瘤提供新的靶标。