裂褶菌F17锰过氧化物酶对偶氮染料的降解作用及其作用机制

合成偶氮染料由于其偶氮和芳香烃分子结构而成为一种难降解污染源。目前，仍无行之有效的处理方法。前期研究发现裂褶菌F17(Schizophyllum sp.F17)合成的胞外锰过氧化物酶（MnP）与白腐真菌的模式种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的MnP具有显著的性质差异，且该酶对刚果红、金橙G等偶氮染料具有较高的脱色能力。因此，本项目在前期工作的基础上，继续深入研究裂褶菌F17 MnP的生化性质及其对偶氮染料的降解动力学和降解途径，并实现MnP高产的营养生理和发酵调控；同时，研究影响MnP催化活性和稳定性的相关因素，构建高效的MnP 作用体系，强化其降解能力，揭示锰过氧化物酶对偶氮染料的降解作用及其机制，其意义在于为偶氮染料污染物的去除提供一条环境友好的新途径，为锰过氧化物酶的工业化应用提供理论支持。

裂褶菌（Schizophyllum sp.F17）为本研究室从自然界分离、保存的一株产锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）的白腐真菌。本项目围绕研究目标，展开了以下主要研究内容：.（1）实验以一定比例的松木屑、稻草和黄豆粉组成的混合营养作为裂褶菌F17发酵产MnP的基质，在固态发酵第6天时，MnP的最大酶活力为11.18 U/g。优化接种量、装载量、温度和含水率等条件，酶活力提高到12.83 U/g。.（2）设计出通气托盘式固态发酵MnP的反应器，并建立了MnP固态发酵过程中菌体生长、酶的产生以及二氧化碳释放速率的动力学模型，获得模型参数，模型在一定程度上反映了裂褶菌F17固态发酵MnP的产生过程。反应器玻璃制成，体积6.4 L，具有通气和散热良好的特点，达到对MnP扩大培养的目的。.（3）经过固态发酵，裂褶菌F17产生以MnP为主的胞外酶。实验通过粗酶提取、盐析、超滤浓缩，DEAE离子交换层析，Sephadex G-75过滤层析等步骤分离得到电泳纯MnP。MnP的相对分子量为45.2KDa，等电点为3.60，含糖量为18 %。在温度15~45℃范围内，MnP的酶活力均较高，最适温度25℃。在pH 4~8范围内MnP均稳定，最适pH为7。.（4）通过简并引物设计，扩增裂褶菌F17基因组，获得606bp的MnP基因中间序列，再分别利用反向PCR和TAIL-PCR技术扩增其两端未知序列，获得MnP完整的基因片段3241bp，其ORF序列为1632bp。该基因包含11个外显子和10个内含子，编码一个由359个氨基酸组成的假定蛋白，推测其分子量为37.9 KDa，等电点（pI）为4.78。GenBank登录号为KC811382。.（5）利用锰过氧化物酶的粗酶液对典型的偶氮染料进行脱色实验，通过设计MnP、LiP、Lac、MnP+LiP、MnP+Lac和LiP+Lac不同的脱色体系，证实了裂褶菌F17分泌的粗酶液中的MnP对偶氮染料脱色起着主要作用。进一步优化了MnP的脱色反应体系，即温度35℃、pH 4.0、0.1 mM H2O2、1.25 mM MnSO4、50mg/l 染料浓度和24U/l MnP，酶反应20min，橙黄Ⅳ、金橙G和刚果红的脱色率分别达到76%、57%和8%。随着酶反应时间的延长，染料的脱色率进一步提高。