ZIP 激酶对于小鼠血管内皮细胞通透性和血管形成的调节

Microvascular endothelium serves the primary base of substance exchange of the body. Proper regulation of its permeability is fundamental for multiple pathological and physiological processes imposed on stress and metabolism etc.Prevalent scheme states that the endothelial permeability is regulated by cell gap formation through contraction evoked by myosin light chain kinase (MLCK) and its myosin light chain phosphorylation. However, our previous results from MLCK knockout mice provides evidence showing no obvious effects of endothelial permeability after ablation of MLCK, implying the existence of an alternative kinase toward myosin light chain phosphorylation. Our preliminary data show that deletion of ZIPK in endothelial cells leads to altered MLC phosphorylation; the ZIPK conditional knockout mice display impaired angiogenesis of lethal embryo. We propose that ZIPK may serve as a primary kinase of myosin light chain phosphorylation in regulation of endothelial permeability, and thereby regulating angiogenesis.In this study, we plan to use the knockout mouse and its mutant primary cells as primary subjects, and investigate the role of ZIPK in endotheilial permeability through systemic phenotypic analysis, cellullar and molecular biological assays. The mission of this project is to elucidate a novel mechanism of endotheilial permeability regulation, and reveal a therapeutic target in this context.

微血管内皮细胞是机体进行物质交换的主要途径，内皮细胞通透性调节对于应激反应、代谢等病理、生理过程和血管发育具有重要意义。传统观点认为，内皮细胞通透性是由于肌球蛋白轻链激酶（MLCK）催化肌球蛋白轻链磷酸化（p-MLC），通过内皮细胞收缩和细胞间隙形成而完成的。我们发现，特异性敲除内皮细胞MLCK后，其p-MLC水平并未改变，通透性也无明显改变，提示存在有新的MLC激酶。我们前期研究发现，内皮细胞缺失ZIPK后，p-MLC发生改变；ZIPK条件性基因敲除小鼠的胚胎发育和血管发育均出现明显异常。我们提出，ZIPK可能是调节内皮细胞通透性的主要激酶，而该调节机制在胚胎血管形成中发挥重要作用。本课题将利用敲除小鼠模型及其原代细胞，通过系列表型分析、细胞及分子生物学方法，系统研究ZIPK在内皮细胞通透性调节中的作用和机制。本课题的完成将提出新的内皮细胞通透性调节机制，为内皮通透性的干预提供实验依据。

微血管内皮细胞(endothelial cell, EC)是机体进行物质交换的主要途径，内皮细胞通透性调节对于应激反应、代谢等病理生理过程和血管发育具有重要意义。肌球蛋白轻链（myosin light chain, MLC）磷酸化及其导致的内皮细胞肌动蛋白骨架收缩可有效增大相邻内皮细胞的间隙，提高内皮细胞通透性，但其调节机制不清楚。有研究发现，Zipk对于骨骼肌和非骨骼肌细胞的收缩均有调节功能。本课题首先利用ZIPK特异性抑制剂staurosporin研究发现，对于脂多糖（LPS）和凝血酶（thrombin）激活的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MLC磷酸化具有显著的抑制效果；利用siRNA敲低HUVEC细胞中Zipk的表达后，其Thrombin 诱导的MLC磷酸化水平结果与ZIPK抑制剂效果一致。我们进一步利用内皮细胞特异性基因敲除小鼠发现，缺失Zipk的小鼠在胚胎期死亡，表明其对于内皮细胞在个体发育中的作用具有重要功能。为了研究其对于内皮细胞通透性调节的作用，我们利用UBC-Cre-ERT转基因小鼠和他莫西芬注射建立了成体Zipk基因敲除小鼠模型（KO）。分离小鼠的脑微血管内皮细胞（brain microvessle endothelial cell, BMEC）以thrombin刺激后发现，KO小鼠BMEC的p-MLC水平和细胞的收缩均被显著抑制。以上结果表明，ZIPK对于内皮细胞的收缩发挥重要调节作用。我们进一步利用小鼠中动脉栓塞（MCAO）模型研究发现，KO小鼠脑组织的缺血／再灌注损伤水平显著低于对照小鼠，提示其血脑屏障的破坏被明显抑制。综上，本课题通过体外和体内，在细胞和整体动物水平的研究发现，ZIPK是内皮细胞MLC磷酸化、细胞收缩和通透性升高的关键调节分子。本课题在国际上首次明确提出并证实了内皮细胞MLC磷酸化的调节分子。我们的研究结果将为脑中风及其它内皮细胞通透性升高相关疾病的治疗提供重要靶点。