谷氨酰胺蓝靛素合成酶的催化机制研究

Indigoidine is biosynthesized by indigoidine synthetase from two molecules of L-Gln. Indigoidine synthetase is an atypical non-ribosomal peptide synthetase with four domains (adenylation, oxidation, peptidyl carrier protein, thioesterase). The oxidation and thioesterase domains may catalyze two novel enzymatic reactions, whose substrates and reaction mechanisms are not clear. Moreover, the dimerization mechanism involved in indigoidine biosynthesis also needs to be addressed. We discovered an indigoidine synthetase gene (idgS) from the genome of Streptomyces lavendulae CGMCC 4.1386 and confirmed it is indigoidine synthetase by heterlogous expression. Soluble protein IdgS was obtained by expressing this gene in E. coli. Bioassay with purified IdgS showed it can form indigoidine with L-Gln as substrate. In this study, we will delineate the detailed biosynthetic pathway of indigoidine and elucidate the catalytic mechanisms of the special oxidation and thioesterase domains of IdgS. Since indigoidine synthetase gene has already been used in several reporter systems, our researches should facilitate the further exploitation on this interesting gene.

谷氨酰胺蓝靛素由谷氨酰胺蓝靛素合成酶催化两分子L-谷氨酰胺聚合而成。谷氨酰胺蓝靛素合成酶属于非核糖体多肽合成酶，含有腺苷酰化、氧化、肽酰基载体蛋白和硫脂酶四个功能域。其中，氧化和硫脂酶功能域可能催化了两个新型的酶促反应，具体的反应过程和催化机制并不清楚。另外，谷氨酰胺蓝靛素生物合成过程中的二聚化机制也有待阐明。我们从淡紫灰链霉菌CGMCC 4.1386的基因组中挖掘得到了谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因idgS，并证明了其功能。在大肠杆菌中表达并纯化了IdgS，初步测试了其催化活性，为进一步的酶学机制研究打下了基础。本项目的研究将力求阐明谷氨酰胺蓝靛素的生物合成机理，解析涉及到的特殊功能域的催化机制。谷氨酰胺蓝靛素合成酶基因已经用于几种报告系统的构建，我们的研究将有助于对其进一步开发利用。

谷氨酰胺蓝靛素合成酶属于非核糖体多肽合成酶，其氧化和硫酯酶功能域可能催化了两个新型的酶促反应，具体的反应过程和催化机制并不清楚。本项目利用大肠杆菌作为宿主，异源表达获得相应蛋白的活化形式Holo-IdgS，在体外建立了谷氨酰胺蓝靛素的合成体系，我们还表达并纯化了蛋白突变体IdgS-TE*及单独的氧化结构域IdgS-OX及环化结构域IdgS-TE，同时利用有机化学合成手段合成了反应中间体类似物。我们借助厌氧条件下反应后的辅因子FMN到FMNH2的信号变化初步判定合成过程中是底物谷氨酰胺先环化后再发生氧化。然而，在尝试建立体外酶学反应时并没有成功，这阻碍了我们对于其催化机制的研究。同时，利用谷氨酰胺蓝靛素合成酶的催化产物谷氨酰胺蓝靛素是一种蓝色分子，我们建立了基于idgS/sfp的用于大肠杆菌的重组质粒的蓝白筛选系统，该方法具有无需额外添加底物和诱导剂的优势。