基于纳米载体介导CTGF特异性siRNA治疗日本血吸虫肝纤维化的实验研究

Schistosomiasis remains one of the most prevalent parasitic infections and has significant public health consequences. Damage to the liver is the main damage of schistosomiasis. Hepatic fibrosis can induce serious consequences, which lead to the death of patients. Currently, there is a tendency to change the epidemiology of schistosomiasis in the era of “preventive chemotherapy” in China. However, hepatic fibrosis can continue to develop. CTGF is a recently discovered important cytokine of promoting hepatic fibrosis. The project intends to design and synthesize magnetic gene vector-mediated CTGF siRNA gene therapy for hepatic fibrosis of schistosomiasis japonica. This study provides a powerful tool for further exploring a new gene therapy way of hepatic fibrosis induced by Schistosoma japonicum infection in future.

血吸虫病仍是严重危害人民健康的重大寄生虫病。我国是世界上日本血吸虫病流行最严重的国家之一。 对肝脏的损害是血吸虫病最主要的损害。肝纤维化是血吸虫病严重的后果 ，进一步发展将导致患者死亡。研究已证实，在有效杀虫治疗之后肝脏纤维化仍可继续发展。如何干预、控制甚至治疗肝纤维化是日本血吸虫病防治的第二个关键。CTGF是一种特异性更强的、可选择性地干预结缔组织形成的细胞因子，阻断其表达可能使较特异、较有效的治疗纤维化的方法。目前，CTGF已成为治疗纤维化疾病的新靶点。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和疾病基因治疗研究领域重要的前沿性课题。本项目拟从体内、体外实验应用RNA干扰技术，以CTGF为靶点设计siRNA,由纳米载体介导，探讨其对日本血吸虫肝纤维化的调控作用和安全性。

目前公认为肝星状细胞 （hepatic stellate cell, HSC） 是肝纤维化形成中产生细胞外基质的主要细胞。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）可能成为替代 TGFβ1治疗纤维化疾病的靶细胞因子。纳米基因转运体的研制是当前国际纳米生物和基因治疗研究领域重要的研究方向。本研究制备了PEI@Fe3O4纳米颗粒，琼脂糖凝胶电泳迁移率实验显示，当Fe与siRNA质量比≥4时，siRNA可完全结合在PEI@Fe3O4纳米颗粒上；血清保护实验显示，PEI@Fe3O4纳米颗粒可以防止siRNA在血清中被降解。采用MTT实验检测PEI@Fe3O4纳米颗粒和PEI@Fe3O4/siRNA复合物对HSC-T6和LX-2的细胞毒性，我们发现当PEI@Fe3O4纳米颗粒用量超过20μg Fe/mL时开始出现细胞毒性，而PEI@Fe3O4/siRNA复合物在0到80μg Fe/mL没有明显的细胞毒性。体外转染实验显示，PEI@Fe3O4纳米颗粒能有效的转运CY3-siRNA进入HSC-T6细胞和LX-2细胞且具有较高的转染效率。RT-PCR 和 Western Blot 结果显示，PEI@Fe3O4/CTGF-siRNA复合物转染 HSC-T6 细胞和LX-2细胞48h后，可以有效下调HSC-T6和LX-2细胞中CTGF mRNA和蛋白的表达、抑制I型胶原(COL-1)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)的分泌。大鼠尾静脉注射PEI@Fe3O4/siRNA纳米复合物后8 h、24 h、7 d，组织切片普鲁士蓝染色结果显示：肝、脾组织注射后三个时问点都可以看到染色的蓝色颗粒，而心、肺、肾组织没有明显的蓝色颗粒分布。测量三个时间点肝、脾的Fe含量，24h 具有最高值。HE染色结果显示，心、肝、脾、肺、肾组织在注射后三个时问点都没有明显的病理结构改变。PEI@Fe3O4/ CTGF siRNA纳米复合物对肝纤维化大鼠模型进行尾静脉注射治疗，结果显示：与模型组相比，注射PEI@Fe3O4/ CTGF siRNA后，肝纤维化病变程度得到明显改善；肝脏组织CTGF含量明显下降；Masson法揭示了治疗后胶原纤维增生有显著缓解；RT-PCR和Western Blot证实CTGF基因和蛋白表达水平经治疗后都有明显下降。