端粒DNA四重折叠结构在端粒DNA复制中的作用

端粒DNA是染色体末端以TTAGGG为单位的重复的DNA序列，起着保护和稳定染色体的作用。端粒DNA在细胞分裂，DNA复制时发生丢失缩短，并逐步导致正常细胞的复制性衰老。绝大多数癌细胞通过端粒酶延长缩短的端粒，维持其长度稳定，是细胞癌变和肿瘤生长的必要条件。端粒DNA的末端复制机制是决定正常细胞端粒长度缩短速度和癌细胞端粒长度平衡的关键因素。我们于2002年提出了可以圆满描述目前已知人细胞端粒末端复制实验数据，解释复制机制的数学模型，并预测了端粒DNA在复制过程中3'末端存在特殊的封闭结构。目前实验室积累的研究结果表明此封闭结构可能与端粒DNA形成四重折叠有关。本申请计划对端粒DNA四重折叠结构在模拟体内环境条件下的性质进行研究，同时通过体外重组端粒DNA复制系统验证端粒DNA四重折叠在端粒末端复制过程中封闭3'末端的预测是否成立，并研究四重折叠结构在端粒DNA复制中的调控机制。

本项目按照计划开展了研究工作，进展顺利，三年期间共发表SCI收录论文8篇，平均影响因子9.34，最高影响因子13.4。.端粒DNA形成的G-四链体(G-四重折叠结构)，抑制端粒延伸。我们发现了一种hnRNP A2*蛋白，它与端粒DNA和端粒酶发生作用，主动打开端粒G-四链体结构，将端粒3’端的5个碱基暴露出来，促进它和端粒酶RNA模板配对，增强端粒酶的催化活性和进行性。在器官组织中，hnRNP A2*的表达水平与端粒酶活性呈正相关。在细胞内hnRNP A2*蛋白伴随着端粒酶共定位于卡佳尔体和端粒。在细胞中人为表达hnRNP A2*可以使端粒延长，降低表达则使端粒缩短。这些说明hnRNP A2*决定了端粒DNA是否可以得到延长，因此它在调控端粒长度平衡，维持细胞的分裂能力中起着重要作用。.G-四链体是重要的药物靶点，需要分析G-四链体结构构象。我们发展了一种小分子诱导极性光切割方法，可以非常容易地测定G-四链体折叠的topology，不论它是在单链，双链，物理学过程，还是在生物学（蛋白质存在）过程中形成的。该方法将为测定G-四链体结构、发展小分子干预G-四链体结构进而影响G-四链体形成和端粒长度和细胞寿命起到促进作用。.目前体外研究核酸G-四链体都是热力学平衡态下最稳定的结构。在生理过程形成的结构是否就是热力学平衡态下结构呢？该问题尚未有研究。我们研究了端粒DNA在生理过程释放后所形成的结构，发现它在模拟细胞内分子拥挤环境下所形成的G-四链体并不是热力学平衡态下的结构，而是受动力学控制首先形成非平衡条下的结构。这一发现回答了一个核酸折叠成G-四链体的基本问题，对理解其生物学功能和靶向药物设计有重要意义。.小分子药物通过稳定端粒G-四链体抑制端粒延伸。我们建立新的分析方法，可以区分通过稳定端粒G-四链体结构来实现的和不通过稳定端粒G-四链体结构来实现的抑制效应。并发现它们都不是通过稳定端粒G-四链体结构来抑制端粒酶的。为鉴定小分子的抑制途径提供了有效技术。.理论上端粒DNA G-四链体结构可在端粒DNA链上任何位置形成。我们曾发现端粒DNA G-四链体结构倾向于在端粒DNA的3'末端形成。我们发现端粒G-四链体形成在端粒DNA的3'末端时将有效抑制端粒酶和ALT机制对端粒的延伸。这一特征为小分子通过稳定端粒DNA G-四链体结构，抑制端粒延伸提供了分子基础。