mRNA m6A甲基化修饰对猪肠道抗菌肽分泌表达的影响及调控机制

Intestinal immune system plays a pivotal role in piglets. Antimicrobial peptides secreted by intestine epithelium are critical innate immune factors that mediate innate and adaptive immunity. Epigenetic modifications (methylation) play a vital role in regulating the development and function of immunocytes. Previous studies have mainly focused on the influence of DNA or histone methylation on immune functions, while few reports on the role of posttranscriptional mRNA methylation in regulating the immune system. Therefore, the present study is designed to analyze the development pattern and correlation between m6A methylation and expression of antimicrobial peptides, clarify the regulation function of m6A modifications on the expression of intestine antimicrobial peptides in epithelial cell, and reveal the mechanism by using m6A-seq to analyze the effect of m6A modifications in RNA stability and translation efficiency. Further, investigate the immune regulation function of methyl donor on the anti-infection ability of piglets. The project may provide theoretical foundation and technical support for the nutritional manipulation of raising healthy pigs in our country.

肠道免疫是仔猪健康的关键，肠道上皮细胞等分泌的抗菌肽是重要的先天免疫因子，参与介导动物先天和获得性免疫。甲基化表观遗传修饰在免疫细胞发育及免疫功能调控上有着重要功能，目前研究主要是集中在DNA甲基化和组蛋白甲基化等对免疫的影响，而转录后mRNA甲基化表观遗传修饰对免疫的作用及机制鲜有报道。因此本研究旨在研究猪肠道m6A修饰与抗菌肽等先天免疫因子分泌表达的规律和相关性基础上，从细胞水平上探讨m6A甲基化表观遗传修饰对猪肠道抗菌肽分泌表达的调控功能，并通过m6A-seq测序，研究m6A修饰对抗菌肽分泌表达等免疫相关基因mRNA稳定性和翻译效率的影响，阐明m6A修饰调控猪肠道抗菌肽分泌表达的机制，并探讨营养活性因子（甲基供体）调控mRNA m6A修饰，进而调控猪抗病菌感染及先天免疫力。本研究将为营养改善猪的肠道健康提供重要的理论基础和技术支撑。

仔猪特别是断奶仔猪的免疫力低下，易感染大肠杆菌，导致腹泻、生产性能下降甚至死亡；猪肠道上皮细胞及其分泌的抗菌肽等先天免疫因子是阻止病原微生物入侵的第一道防线。近年来，表观遗传特别是甲基化的修饰作用是国内外研究热点，但主要局限于DNA甲基化和组蛋白甲基化，而重要的转录后水平mRNA甲基化功能的研究鲜有报道。. 本项目以大肠杆菌感染的仔猪和肠道上皮细胞IPEC-J2为研究模型，利用基因敲除技术、mRNA甲基化测序技术、转录组测序技术、染色质/蛋白质免疫共沉淀技术等手段深入探究了mRNA甲基化m6A在大肠杆菌K88感染诱导猪内源抗菌肽表达过程中的作用、分子机制及营养调控策略。. （1）本项目在解析大肠杆菌感染过程中m6A修饰水平和抗菌肽分泌表达规律的基础上，发现缺失m6A的甲基转移酶METTL3显著抑制了大肠杆菌K88感染导致的β-defensins的表达升高。（2）通过MeRIP-seq测序发现，m6A修饰水平差异基因GPR161是m6A调控感染过程中β-defensins表达的关键因子，缺失GPR161能够显著抑制大肠杆菌K88感染导致的β-defensins的表达升高。（3）进一步针对METTL3缺失前后的细胞进行mRNA-seq以探究其机制，结果发现转录因子FOXO6在感染过程中与METTL3关系密切，而蛋白质免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀实验证实，METTL3是通过招募FOXO6启动GPR161的转录调控GPR161的表达水平，进而调控β-defensins的表达。（4）依据解析的感染过程中抗菌肽高表达的内在分子机制，研发了一套以三甲基甘氨酸、胆碱等增强m6A修饰，提高猪内源抗菌肽分泌表达的营养调控技术。. 本研究从表观遗传的角度，解析了大肠杆菌感染过程中猪肠道抗菌肽分泌表达的分子机制，为营养改善猪的肠道健康提供重要的理论基础和技术支撑。