新型双功能肽负载siRNA治疗肝癌的实验研究

Hepatocellular carcinoma, which is the major malignant tumor of the liver, is a disease with poor prognosis due to lack of effective treatment, making it essential to identify novel therapeutic targets. RNA interference could specifically down-regulate the expression of the target gene, and thus hold a great potential for application in the treatment of cancers. Lack of safe and effective delivery carriers is one of the major drawbacks to its clinical application. Safety concerns hinders the application of viral carriers while the nonviral carriers are limited by their relatively lower transgenic efficacy. In our previous work, an innovative bifunctional peptide was designed and synthesized, which was comprised of a cell penitrating peptide (MPG△NLS) and a hepatoma targeting peptide (LHRH).Cell transfection results demonstrated that it could specifically delivered the siRNA into hepatoma cells and significantly knok down the expression of the target gene. The proposed study is aimed at inestigating the factors influencing the effects of trasgenic efficacy and regulation of target gene, the biodistribution of the delivered siRNA in hepatoma model mice and curative effect of the delivered β-catenin-siRNA, which has been confirmed as an effective siRNA for inhibiting the growth of hepatoma cells.

肝细胞肝癌是严重威胁人类生命的高发、高致死率肿瘤，尚缺乏特异有效的治疗手段。RNA干扰技术具有特异抑制相关靶基因的优越性，在肿瘤治疗中具有巨大应用潜力，安全、特异和高效的siRNA运送载体的缺乏是限制其应用于肿瘤临床治疗的瓶颈之一。安全性因素限制了病毒载体的应用；而非病毒载体则受制于转基因效率的低下。我们设计合成了由穿膜肽（MPG△NLS）和肝癌细胞靶向多肽（LHRH）融合形成的双功能肽，初步结果显示，该肽可将siRNA特异地递送到肝癌细胞中，并显著抑制了靶基因的表达，明显优于Lipofectamine递送效果。本研究拟采用此载体负载对肝癌细胞生长具有明显抑制作用的β-catenin-siRNA，系统探讨影响肝癌靶向递送和靶基因调控效果的因素，观察其在体内组织器官分布情况并对其生物安全性进行初步评估，通过体内、外研究观察其对肝癌细胞的抑制作用及影响因素，为其应用于临床治疗提供实验依据。

本项目旨在发展可用于肝癌治疗的纳米药物控释技术，主要完成了两大部分研究内容。一、设计合成了具有肝癌细胞靶向作用的新型双功能肽LHRH-MPG△NLS，用以负载对肝癌细胞生长具有明显抑制作用的siRNA，探讨了其应用于肝癌治疗的可行性。结果显示，LHRH-MPG△NLS可与siRNA通过自组装形成纳米粒子，在水溶液中稳定性良好；细胞实验表明与脂质体转染试剂相比，LHRH-MPG△NLS/siRNA纳米复合物细胞毒性低，并对肝癌细胞具有良好靶向性；LHRH-MPG△NLS/siRNA-GAPDH纳米复合物对人肝癌细胞中GAPDH基因具有显著沉默效果；LHRH-MPG△NLS负载Stat3-siRNA对肝癌细胞生长具有明显抑制作用；LHRH-MPG△NLS/Stat3-siRNA复合物与药物Icarrin联用对肝癌细胞生长的抑制作用有所增强；通过荷瘤小鼠观察了HRH-MPG△NLS负载Stat3-siRNA静脉给药对肝癌生长的影响，结果显示对肝癌生长没有明显作用，与预期不一致。二、采用TAT-壳聚糖（TC）对多壁碳纳米管进行修饰，负载抗癌药物阿霉素，探讨了热疗/化疗联合对肝癌的治疗效果。取得了一下主要研究成果：设计合成了TAT多肽-壳聚糖交联物TC，采用其对多壁碳纳米管（MWCNTs）进行修饰，TC修饰的碳纳米管（MWCNTs-TC）具有水溶性好、细胞摄取率高、细胞毒性低的优点，荷瘤小鼠体内分布研究显示其对肿瘤具有被动靶向作用。在上述工作基础上，通过分子层层自组装方法，研制了一种新型阿霉素（DOX）纳米药物递送系统-MWCNT/DOX/TC，其载药效率高，在溶液中的稳定性好，容易被细胞摄取，进入细胞后主要分布于细胞质，基本不进入细胞核；药物释放研究显示，MWCNT/DOX/TC载药系统具有较好的药物缓释作用，在近红外（NIR）作用下具有热转换效率高、对肝癌生长抑制作用显著的优点，提示其在包括肝癌的多种肿瘤化疗/热疗联合治疗中具有很好的应用价值。