HSF1基因在奶牛热应激过程中的表达调控机制研究

Heat shock transcription factor 1 (HSF1) can directly activate the expression of genes involved in protein folding and degradation in response to heat stress, which help organism defend on heat stress. However, the mechanisms of the regulation of HSF1 expression under heat stress condition in dairy cattle remain unclear. Our previous studies indicated that the variation of HSF1 gene (miRNA potential target) affects the heat tolerance trait in dairy cattle and the results of gene expression profile showed that HSF1 gene mRNA expression level is different in different tissues. At the same time, a novel alternative splicing pattern was found in HSF1 gene. On the base of our previous results, we propose the hypothesis that the expression mode of HSF1 gene in dairy cattle under heat stress condition may be regulated by alternative splicing and miRNA. We infer that HSF1 gene play the important role on heat tolerance in dairy cattle through the alternative splicing and miRNA mediated post-transcriptional regulation. So, qRT-PCR and bioinformetics methods will be used to investigate splice pattern, expression level, mechanism of splice of HSF1 gene in different tissues in dairy cattle. Vector construction, cell transfection and luciferase report system will be used to study the interaction between miRNA and HSF1 and to identify the SNP in miRNA target. The mechanism of the regulation of HSF1 gene expression under heat stress condition may be revealed, which would provide theory for anti-heat breeding in dairy cattle.

热休克转录因子1(HSF1)在热刺激下能帮助变性蛋白折叠和修复，启动对抗热应激的防线，但该基因在奶牛热应激过程中的表达调控机制尚不清楚。我们发现HSF1基因突变(miRNA潜在靶标)影响奶牛的耐热性能，而且组织表达差异显著，有可变剪接现象。基于本课题组前期进展，我们提出"热应激奶牛HSF1基因的表达模式受到可变剪接和miRNA的调控"的假设，认为奶牛HSF1基因可通过不同剪接体和miRNA介导的基因表达调控对耐热性发挥重要作用。拟利用qRT-PCR和生物信息学方法研究热应激奶牛不同组织HSF1剪接形式、表达水平和剪接机制。通过载体构建、细胞转染和荧光素酶报告基因系统研究miRNA和HSF1的互作关系，鉴定miRNA靶标SNP。揭示热应激过程中奶牛HSF1基因的表达调控机制，为奶牛耐热育种提供参考依据。

本项目按照预定计划开展并超额完成了相关工作。目前，已发表SCI收录论文1篇，正在撰写英文文章1篇。研究了奶牛心脏、肝脏、脾脏、肾脏和乳腺组织中HSF1基因剪接体形式，利用qRT-PCR技术对不同组织剪接体进行mRNA表达差异分析。另外，发现HSF1基因第10外显子上存在一个SNP（g.4158 C>T），恰巧处于一个潜在的ESE域内，利用ESEfinder 3.0软件分析发现，发生此突变后增加了SRSF1、SRSF1 (IgM-BRCA1)两种SR剪切蛋白的结合，减少了SRSF1、SRSF2和SRSF53种SR剪切蛋白的结合，并且HSF1-AS3剪接体发生剪切的位置恰好处于此SNP附近，推测其可能参与了剪切过程。. 应用靶标miRNA预测软件Targetscan和RNAhybrid分析了与HSF1基因3´UTR 结合的miRNAs。结果显示，与bta-miR-484种子序列区结合的HSF1基因3´UTR区域SNP，可能会影响 bta-miR-484与靶基因的结合。提示 miRNA可能对HSF1基因有重要的调节作用，但还需进一步研究。根据HSF1 3´UTR序列信息设计扩增引物，以牛的基因组DNA为模板PCR扩增HSF1基因的3´UTR序列，将其克隆到pmiR-RB-REPORT™双荧光素酶报告载体中，报告荧光为hRluc，校正荧光为hluc。构建HSF1 3´UTR载体，转染细胞，通过荧光素酶报告载体系统对miRNA和靶基因HSF1间的相互作用进行结构学验证，初步确定了HSF1基因3´侧翼区SNP影响miRNA与HSF1的相互作用。. 根据国内外该领域的研究进展，本课题组增加了奶牛的PPARα基因的遗传变异及其与奶牛耐热性关系的研究，为本课题丰富了新的内容。利用PCR技术对771头中国荷斯坦牛的内含子3和内含子7进行了扩增，通过测序发现3个SNPs，44087 (G/A)、65550 (G/A)和65676(G/A)。采用PCR-RFLP技术对三个位点进行了基因分型，并进行单倍型构建，对不同基因型和基因型组合对奶牛耐热性的影响进行了相关性分析。结果发现H8H8单倍型组合个体红细胞钾含量、产奶量下降率和直肠温度均较低。这些结果表明，H8H8单倍型组合是奶牛中提高耐热性的有利单倍型组合，为奶牛耐热育种提供了参考。