猪肠外致病性大肠杆菌六型分泌系统致病机制研究

Porcine Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli (ExPEC) is an important bacterial pathogen which can seriously harm the healthy and rapid development of the pig industry and also threat to public health. The whole genome sequencing has showed some virulence associated genes differences including a novel protein secretion system Type Ⅵ secretion system (T6SS) between the porcine ExPEC strong and weak virulence strains. Hcp and VgrG are T6SS important functional protein, compared with other pathogens T6SS, pig ExPEC virulent strain contains three Hcp proteins and four VgrG proteins. Further studies confirmed the porcine ExPEC T6SS plays an important role in the virulence and the interbacteria competition by hcp mutant construction and virulence experiment but the mechanism remains unclear. In this study, we investigate the T6SS assembly and pathogenic mechanisms of porcine ExPEC T6SS by using protein expression, gene deletion mutant construct, bacteria and host interaction detection and comparative proteomics. This study will make a solid foundation for understanding the pathogenic mechanism of porcine ExPEC.

猪肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）不仅给养猪业带来巨大的经济损失，还严重威胁着公共卫生安全。本课题组前期已完成自行分离鉴定的猪ExPEC强毒菌株（PCN033）和弱毒菌株（PCN061）的全基因组测序，发现一些跟毒力相关的基因存在差异，其中包括Ⅵ型分泌系统（T6SS）。Hcp与VgrG是T6SS的重要功能蛋白，与其他病原菌T6SS比较，猪ExPEC强毒株含有3个Hcp与4个VgrG蛋白。进一步通过Hcp缺失以及毒力试验等初步证实猪ExPEC的T6SS在细菌的毒力以及细菌间的竞争性生长中发挥着重要作用。但对于猪ExPEC的T6SS的组装、效应分子以及作用机制等并不清楚。本研究拟通过蛋白表达与定位、基因缺失突变株构建与毒力试验、细菌与宿主互作、比较蛋白质组学等方法来确定T6SS组装及在致病中的具体作用机制，从而为揭示猪ExPEC致病机制奠定重要基础。

自2006年“猪无名高热综合征”暴发以来，猪肠外致病性大肠杆菌已经成为严重危害我国养猪业健康发展的重要病原菌之一。VI型分泌系统（T6SS）在大部分革兰氏阴性菌株的生长及致病过程中发挥着重要的作用。前期通过全基因组测序及比较基因组研究，发现猪肠外致病性大肠杆菌强毒菌株PCN033存在着一个24.9Kb的T6SS基因簇。T6SS在猪肠外致病性大肠杆菌中是否具有功能？本项目首先分别构建了T6SS核心基因hcp或者vgrG所有基因缺失的缺失突变株，通过细菌竞争实验、细胞粘附与侵入能力以及小鼠毒力实验等比较野生菌株与缺失菌株间的差异，证实T6SS在PCN033的竞争与致病中发挥着重要作用。PCN033菌株中存在着3个hcp基因及4个vgrG基因，他们的功能是否相同？进一步构建了单基因缺失菌株的方法，通过体内外表型比较试验阐明hcp2基因在细菌的竞争中发挥重要作用，hcp1和hcp3基因在细菌与宿主细胞的互作中发挥作用。4个vgrG基因中，vgrG2和vgrG4不具有完整的功能域，没有功能，vgrG1基因位于基因簇内，对T6SS的功能具有重要作用，vgrG3基因位于基因簇外不转录。通过生物信息学等方法预测到PCN033潜在的T6SS效应分子rhs1-4。研究发现四个Rhs基因中，rhs1、rhs2和rhs3的C端具有较强的抗菌活性，同时体内外实验证明rhs1与毒力密切相关。免疫蛋白rhs2I和rhs3I能中和rhs2CT、rhs3CT的毒性。同时我们研究发现基因簇内的0229基因能够负调控T6SS的表达。本项目的开展揭示了猪肠外致病性大肠杆菌T6SS的组成、功能及作用机制，为我们深入理解猪肠外致病性大肠杆菌的致病机制及T6SS的功能奠定了重要基础。本项目发表致谢SCI论文8篇，修回1篇，培养博士毕业研究生1名，硕士研究生6名，申请专利一项。