家族乙肝感染中关键lncRNAs的筛选及其在HBV宫内感染中作用的研究

Plenty of studies show that the main way of HBV intrauterine infection is thansmitted through placenta, However, the molecular mechanism remains unclear.In our study on the basis of HBV intrauterine infection about more than 20 years,We found that HBx and cell apoptosis are very important in HBV intrauterine infection. we are going to construct the expression profile of lncRNAs in the placental cells effected by HBV by high-throughput strand-specific transcriptome sequencing and potential key lncRNAs in the regulation of maternal-infant HBV transmission are to be selected.then we are going to detect the effects of key lncRNAs gene transfection on the apoptosis, invasion and secretion of trophoblast cells and detect the key lncRNAs transcription level changes of HBx gene transfection trophoblastic and the proteins that interact with key lncRNAs.We are going to construct the HBV transgenic pregnant rat models, we inject the eukaryotic expression vector of the potential key lncRNAs, and determine key lncRNAs affect intrauterine infection rate with the detection of those maternal and infant rats blood hepatitis B markers and HBVDNA.After delivery the levels of HBx protein, invasion-related protein, apoptosis-related protein and apoptosis were detected in the placenta cell, and the levels of TNF-α, IL-6 and progesterone were measured in umbilicalcord blood.In order to clarify the mechanisms of key lncRNAs on HBV intrauterine infection. It is conformed for first time that lncRNAs plays a great role in the Intrauterine transmission and placenta Infection of HBV.

HBV宫内感染主要途径是经胎盘传播，但其分子机制仍不清楚。我们在20余年HBV宫内感染研究的基础上，证实HBx蛋白和细胞凋亡在HBV宫内感染中起重要作用。本课题应用链特异性高通量测序技术构建HBV感染胎盘细胞lncRNAs的表达谱并筛选其关键lncRNAs；检测关键lncRNAs基因转染滋养细胞对细胞凋亡、侵袭及分泌功能的影响；检测HBx基因转染滋养细胞关键lncRNAs转录水平的变化及与关键lncRNAs相互作用蛋白；构建HBV转基因妊娠鼠模型，注射关键lncRNAs的真核表达载体，检测母鼠和仔鼠血乙肝系列和HBVDNA，判定lncRNAs对HBV宫内感染的作用。分娩后检测胎盘细胞HBx蛋白、侵袭相关蛋白、凋亡相关蛋白及细胞凋亡水平，检测脐血清TNF-α、IL-6和孕激素水平，明确lncRNAs调节HBV宫内感染的作用机制。首次证实lncRNAs在HBV感染胎盘及宫内感染中有重要作用。

我国为乙肝病毒（HBV）感染的高发区，慢性HBV携带者超过9500万。主要由母婴传播所致。HBV母婴传播可发生于宫内，产时和产后。HBsAg阳性母亲的新生儿出生后立即接种乙肝疫苗(HBVac)或联合应用乙肝免疫球蛋白(HBIG)可有效阻断产时感染和产后感染，但对宫内感染无阻断作用。新生儿联合预防后仍有5%~15%发生慢性HBV感染，宫内感染是乙肝免疫失败的重要原因之一。因此，宫内感染机制和阻断措施的研究尤为重要。.我们通过对外周血单个核细胞进行单细胞转录组测序，比较了HBV感染和健康孕妇之间细胞和分子特征的差异，结果发现与健康孕妇相比，HBV感染的孕妇可能有更活跃的免疫反应，并且确定了一个独特的活化CD8+T细胞子集，其中MTs是差异最显著基因。我们还在HBV相关样本中的T细胞克隆型中发现了不同的V/J基因。这些发现可能有助于进一步了解HBV感染孕妇的免疫相关发病机制，并为未来改善妊娠期HBV治疗提供理论依据。.替诺福韦是阻断HBV宫内感染的关键用药，因此我们进行了HBV感染孕妇应用替诺福韦的临床和基础研究。临床研究的结果表明家族性乙肝孕妇与非家族乙肝孕妇使用替诺福韦在不良妊娠结局和停药后临床指标上存在差异，并且证实了替诺福韦阻断HBV宫内感染是有效和安全的，中孕期是替诺福韦较好的用药时机，为替诺福韦在临床的规范应用提供了循证医学证据。.在基础研究中，WGCNA分析和富集分析表明TDF治疗后HBV感染孕妇外周血中关键模块中的基因主要富集于Th1/Th2细胞分化调控、病毒转录等。TDF治疗后，HBV感染孕妇PBMCs中LINC00662表达下调。低表达的LINC00662在淋巴细胞介导的免疫负调控中富集，并与免疫系统中的细胞因子信号转导有关。体外细胞实验表明LINC00662影响IFN-γ和TNF-α的分泌。因此LINC00662在HBV感染孕妇外周血免疫功能调节中发挥重要作用，为进一步阻断HBV母婴传播提供了一种新的治疗策略。此外miRNA相关研究表明TDF可能通过抑制外周血hsa-let-7g-5p表达促进滋养细胞的凋亡从而减少胎盘滋养细胞内HBV的复制，对促进HBV的母婴阻断有重要作用。