基于高通量测序技术的宏基因组学与宏转录组学在环境样品抗生素抗性基因全谱表征和宿主溯源中的应用研究

The occurrence, spread and transformation of antibiotic resistance genes (ARGs) have recently drawn great attention all over the world. In this study, activated sludge in the antibiotic production wastewater treatment plant will be selected as the model of environmental sample to conduct the ARGs full-spectrum characterization and ARGs microbial source tracking study using the high-throughput sequencing based metagenomics approach as well as metatranscriptomics approach. This study mainly focuses on (1) comprehensive integration and establishment of antibiotic resistance genes database, (2) full-spectrum characterization and quantification of ARGs in complex environmental samples,(3) identification of antibiotic resistant bacteria, (4) full-spectrum characterization of ARGs expression under high antibiotic stress, (5) the location of ARGs on genetic elements, and (6) the occurrence profiles of ARGs on extracellular/intracellular DNA, dead/live cell intracellular DNA under different chlorination conditions. The successful establishment of a set of standard ARGs detection and quantification approach will provide technique support for the following study of ARGs occurrence pattern and their fate within large-scale environments. Meanwhile, the success of this study will also demonstrate the feasibility of utilizing both high-throughput sequencing based metagenomics approach and metatranscriptomics approach to investigate the microbial source tracking of ARGs in complex environmental samples. This study could provide technical reference for the similar studies in the future. Additionally, the conclusions and results of this project could also be used as scientific evidences to formulate the discharge standard of ARGs in wastewater or solid waste from the ARGs pollution industry which needs the highest priority control.

抗生素抗性基因（ARGs）在环境中的分布特征和扩散机制已成为国内外研究热点。本项目选取抗生素生产废水处理系统中活性污泥作为模式环境样品，率先使用基于高通量测序技术的宏基因组学和宏转录组学手段，深入开展抗生素制药厂废水处理系统中ARGs全谱图表征和宿主溯源的相关研究，包括：1）ARGs数据库的构建；2）复杂环境样品中ARGs全谱图定量检测；3）ARGs携带细菌的基因型鉴定；4）高浓度抗生素胁迫条件下ARGs的表达特性；5）ARGs所在遗传元件的定位和 6）不同加氯消毒条件下ARGs在胞内/胞外DNA，死细菌/活细菌胞内DNA中的分布规律表征。通过建立复杂样品中ARGs定量检测标准方法，为ARGs在大尺度不同环境中的分布特征和扩散机制研究提供技术支持，同时展示了宏基因组学/宏转录组学手段在环境样品ARGs宿主溯源研究中的可行性，并为制订ARGs在优控污染行业废水/废物中的排放标准提供科学依据。

抗生素抗性基因（ARGs）在环境中的分布特征和扩散机制已成为国内外研究热点。然而，目前对高浓度抗生素环境中大部分ARGs的发生特征、ARGs的宿主细菌、ARGs的共存关系等还不明确，对抗生素耐药菌（ARB）的多重抗性认知有限。因此，本项目通过进行单一抗生素高浓度暴露模拟试验，以抗生素生产废水处理模拟系统中的活性污泥为研究对象，使用基于高通量测序技术的16S rRNA基因和宏基因组学分析对抗生素选择压力下微生物群落组成、ARGs赋存特征、ARGs 的宿主细菌及多重抗性、ARGs与可动遗传元件（MGEs）共存特征等进行了研究。.16S rRNA基因分析表明高浓度抗生素选择压力降低了微生物多样性，改变了主要群落的组成特征，并且这与抗生素类型及浓度有直接关系；在检测出的23个门和219个属中，一些菌属对一种或多种抗生素产生了耐药性，被鉴定为潜在的ARB。宏基因组学分析表明抗生素类型和浓度的差异赋予了ARGs不同的赋存特征；在检测到的20种ARGs类型和539个亚型中，磺胺类抗性基因平均丰度最高；特定抗生素选择压力同时增加了对应和非对应类型ARGs的丰度，表现出了明显的协同富集效应；微生物群落与ARGs组成具有显著相关性。宏基因组组装结果表明抗生素选择压力下不同处理组间携带ARGs的主要菌属组成不同，一些致病菌也被鉴定为携带一种或多种ARGs的潜在宿主；各处理组共有ARGs组合特征表现出了协同抗性及共选择机制；抗生素选择压力促进了MGEs和金属抗性基因的发生，具有共选择效应。宏基因组分装方法复原的459个基因组中包括一些不可培养和16S基因分析未检测出的细菌；共有100个基因组被鉴定出携带ARGs，这些ARGs的宿主细菌由12个门组成，共携带了10种类型的ARGs；31个基因组携带了多个不同类型的ARGs，具有多重抗性特征；基因组的物种分类及所携带ARGs类型的不同共同导致了ARGs宿主细菌在进化关系上的远近，也反映了抗生素耐药性的进化特征。本研究为进一步阐释抗生素耐药性的分子机制和ARGs的传播机制以及抗生素耐药性的生态健康风险评估和传播防控提供了技术支持和理论依据。