DAPK1致中性粒细胞凋亡促进急性肺损伤炎症消退的机制研究

。Our previous report suggested that pro-resolution is a novel therapeutic strategy for acute lung injury. Neutrophil apoptosis is a check point for the resolution of inflammation. So, resolution of acute lung injury is obtained via promoting neutrophil apoptosis. Our preliminary experiment and other's report showed that death associated protein kinase 1 (DAPK1) knock out aggrevated the acute lung injury. According these findings we hypothesize that DAPK1 phosphorylates p53, which will accumulate, and then enhance neutrophil apoptosis and resolution of inflammation during acute lung injury. So, we will test this hypothesis in present proposal by using DAPK1 knocked out mice and other techniques. Aim 1, we will observe the effect of DAPK1 on the neutrophil apoptosis and resolution of acute lung injury. Aim 2, we are going to investigate influence of catalytic activity of DAPK1 on the neutrophil apoptosis and resolution of acute lung injury. Aim 3, the interaction of DAPK1 and p53 will be studied. Aim4, we will confirm that p53 is a downstream molecular of DAPK1. The finding of present proposal will provide clear evidence for us to learn about molecular mechanism of resolution of acute lung injury.

我们前期研究表明，促进炎症消退是急性肺损伤新的有效治疗措施。中性粒细胞凋亡是炎症从发生发展向消退转变的关键环节，促进中性粒细胞凋亡可以促进急性肺损伤炎症消退。我们的预实验和其它报道表明：死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）敲除可以导致急性肺损伤加剧；诸多线索提示p53可能是DAPK1导致中性粒细胞凋亡的下游信号分子。因此，我们提出研究假设：DAPK1激活导致p53聚集，p53增多导致中性粒细胞凋亡，从而促进急性肺损伤炎症消退。本项目拟利用我们已有的基因敲除小鼠并结合多种技术手段，开展以下研究工作：首先，研究DAPK1对中性粒细胞凋亡和急性肺损伤炎症消退的影响；其次，研究DAPK1催化活性对中性粒细胞凋亡和急性肺损伤炎症消退的影响；然后，寻找DAPK1与p53结合的位点；最后，明确p53是否为DAPK1导致中性粒细胞凋亡的下游信号。本项目将为深入认识急性肺损伤炎症消退的分子机制提供新的实验依据。

急性肺损伤（ALI）是由脓毒症、创伤、感染等因素导致的急性低氧性呼吸功能不全，患者肺部失控的炎症反应主要可引起肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞的损伤，导致弥漫性肺间质及肺泡水肿，造成肺功能受损。其中，促进中性粒细胞凋亡有利于炎症反应及时消退，对ALI具有保护作用。死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）是一类丝/苏氨酸的蛋白激酶，可以促进多种类型细胞凋亡，是肿瘤调节的重要靶点。5-氮杂-2-脱氧胞苷（Aza）作为一种DAN甲基转移酶抑制剂，可通过上调DAPK1的表达抑制肿瘤的发生发展。由于肿瘤的发病机制与炎症反应密切相关，因此，我们主要研究Aza是否可通过调节中性粒细胞中DAPK1的表达诱导中性粒细胞凋亡，从而促进ALI炎症反应消退。离体实验中，我们采用中性粒细胞HL-60细胞系（dHL-60）作为中性粒细胞模型。我们观察到，Aza加入dHL-60细胞中培养可以促进细胞凋亡，其主要是通过抑制NF-κB的活性并上调促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2来实现的，这与dHL-60细胞中DAPK1的表达水平密切相关。在体实验中，我们采用小鼠气管内滴注LPS建立急性肺损伤模型。Aza治疗后可减轻急性肺损伤小鼠的炎症反应，同时通过减轻肺水肿，修复肺损伤、降低支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞的浸润促进ALI炎症反应消退。此外，Aza还可下调LPS诱导的促炎因子TNF-α, IL-1β, IL-6 和MCP-1的表达并增加抗炎因子IL-10的表达水平。此外，Aza可以促进小鼠中性粒细胞中DAPK1的表达，并且诱导BALF中性粒细胞的凋亡。然而，无论在体内还是体外，当DAPK1的表达被抑制后，Aza不能够发挥其促进细胞凋亡的作用。同样的，当DAPK1被抑制时，Aza并不能发挥其对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用。因此，基于以上研究结果，我们可以得出结论，Aza通过促进DAPK1表达诱导中性粒细胞凋亡，从而加快了LPS诱导的ALI炎症反应消退进程。据我们所知，这是第一次证明Aza可通过调节DAPK1表达抑制LPS诱导的中性粒细胞存活。DAPK1有望成为ALI治疗的新靶点，这为ALI的治疗提供了新的思路。同时，我们进一步强调了促进中性粒细胞凋亡在炎症消退阶段所起到的积极作用。