脱氧鬼臼毒素（DOP）对美洲大蠊DUM神经元N型乙酰胆碱受体（nAChR）作用机制研究

脱氧鬼臼毒素（DOP）是来源于植物，对昆虫神经系统有独特作用的物质。对美洲大蠊的毒杀表现出典型的烟碱样症状。本项目以美洲大蠊背中线不成对中间（DUM）神经元为标本，采取胞外作用与胞内调节相结合的研究方法探讨DOP对烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的作用机制。采用放射性配体实验和免疫印迹技术研究DOP与nAChR的结合特点和对受体蛋白的作用方式；采用全细胞膜片钳技术研究DOP与nAChR作用后引起的受体通道的变化特征。同时观察DOP对DUM神经元胞内调节nAChR活性的重要物质 CaM、cAMP、PKA｜和钙调蛋白激II( CaMK II)的影响。通过多环节多层次的研究，明确DOP对美洲大蠊DUM神经元nAChR的作用机制，提出DOP作用于昆虫nAChR的作用机制，为探索植物源杀虫剂提供新的实验依据。

脱氧鬼臼毒素（DOP）来源于植物，对昆虫神经系统有独特作用，对美洲大蠊的毒杀表现出典型的烟碱样症状。本项目以美洲大蠊背中线不成对中间（DUM）神经元为标本，采取胞外与胞内调节相结合的研究方法探讨DOP对烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的作用机制。采用全细胞膜片钳技术研究DOP与nAChR作用后引起的受体通道的变化特征，发现：0.1-100 μmol/L 的DOP使美洲大蠊DUM神经元N型乙酰胆碱受体通道电流减小，并呈现出浓度依赖性（IC50为12.919μmol/L，Hill系数为2.0131），该抑制作用具有可逆性。DOP对ACh激活电流的抑制作用呈现非电压依赖性。10 μmol/L DOP对ACh激活电流有明显抑制作用，但两曲线的EC50较为接近，无显著性差异（n = 6，P > 0.05）,提示DOP对ACh激活电流的抑制作用是非竞争性的，即DOP并非与ACh作用于nAChR的同一位点。. 根据同源性较近的昆虫物种设计出美洲大蠊nAChR，CaM和CaMII的简并引物，克隆了的基因序列。通过与NCBI数据库比对表明：美洲大蠊nAChR基因部分序列（539bp）与赤拟谷道nAChR相似度为84%；CaM（435bp）与雕叶蝉等昆虫的相似度为83%；CaMK2（538bp），与果蝇的相似度为77%。实时定量荧光PCR实验表明：10-150μmol/L的DOP对美洲大蠊nAChR α6亚基、CaM和CaMII的表达量表现出低剂量激活，高剂量抑制的特点，45-80μmol/L激活最明显。. 通过实验可以证明申请书中提出的美洲大蠊的毒杀表现出“烟碱样症状”的假设：DOP与nAChR结合之后，胞内钙离子浓度升高，胞内钙稳态变化，激活CaM，引发级联反应：一方面促使ATP水解成cAMP,为PKA磷酸化受体胞内结构提供磷酸化基团引发兴奋作用；另一方面，活化的CaMKⅡ一部分与受体直接发生交互作用引发兴奋作用，另有一部分在cAMP浓度饱和之后被激活使得被磷酸化的受体去磷酸化，启动抑制路径。低浓度的DOP组中，nAChR、CaM 表达量升高，磷酸化占主要地位，显示出兴奋效应；高浓度DOP组中， nAChR、CaM、 CaMKⅡ表达量下降，去磷酸化占主导地位，显示抑制效应nAChR关闭。