基于PI3K-Akt通路抑制作用的苍耳子中噻嗪类抗类风湿性关节炎成分及作用机制研究

Xanthii fructus contained various xanthiazone compounds in our previous study. Further pharmacological investigations indicated that this type xanthiazone compounds showed significant anti-rheumatoid arthritis activity and the mechanism may be the inhibiting of phosphatidyl inositol 3-kinase γ protein (PI3Kγ). On the basis of previous work and the combination of advanced multidisciplinary methods and technology, we aim to systematically investigate the anti-rheumatoid arthritis activity, therapeutic targets, structure-activity relationships and mechanism of action. Based on the methodology integrated UPLC-Q-TOF-MS, a variety of chromatography technology and spectroscopic approaches, xanthiazone compounds will be rapidly screened, isolated and identified. Application of SPR and WesternBlot technology, we will screen target compounds of binding force better for PI3Kγ protein and verify the inhibition against PI3Kγ protein. In addition, virtual screen method will be also used to analyze the structure-activity relationships between bioactive xanthiazone compounds and PI3Kγ. Finally, we will study the influence between xanthiazone compounds and RAFLS cell apoptosis. In this way, our findings will establish solid scientific foundation for the development of new anti-rheumatoid arthritis drug.

本课题组前期研究发现苍耳子中富含特有的噻嗪类化合物，进一步研究发现该类成分具有抗类风湿性关节炎(RA)活性，深入研究证明噻嗪类化合物是通过抑制PI3K-Akt通路中PI3Kγ蛋白而发挥抗RA作用，本项目拟在前期研究基础上，整合中药化学、药理学，分子生物学等先进科学手段与方法，针对有效部位中噻嗪类成分抗RA的体内外活性、作用靶点，构效关系及作用机制进行研究。采用UPLC-Q-TOF-MS对噻嗪类化合物快速识别后分离鉴定，应用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance, SPR)筛选与靶标蛋白PI3Kγ结合力较好的目标化合物，并采用WesternBlot技术验证噻嗪类成分对PI3Kγ的抑制作用，结合计算机辅助筛选技术深入剖析噻嗪类成分的抗RA构效关系，最终考察此类成分对成纤维样滑膜细胞凋亡的影响，从而阐释苍耳子中噻嗪类成分抗RA的作用机制，为开发抗RA新药奠定基础。

本项目在确定了苍耳子抗RA有效部位的基础上，应用UPLC-Q-TOF-MS对苍耳子有效部位中化学成分的组成进行了快速识别分析，发现了结构新颖的噻嗪类化合物，通过观察其碎片离子，总结了噻嗪类化合物结构特点和质谱裂解规律。并对有效部位进行了系统深入的化学成分研究，共分离鉴定了81个单体化合物，包括19个新化合物，45个首分化合物。建立了TNF-α诱导的RAFLS细胞模型，考察了噻嗪类化合物体外抑制TNF-α诱导的RAFLS细胞增殖作用，并获得量效关系。建立了Ⅱ型胶原蛋白和弗氏完全佐剂所致的RA大鼠模型，综合分析了噻嗪类化合物的抗RA作用。应用Autodock分子对接程序计算了噻嗪类化合物与PI3Kγ蛋白的分子对接情况，获得了噻嗪类化合物与PI3Kγ蛋白分子结合的最佳构象，结合位点和结合方式。利用SPR技术，将PI3Kγ蛋白固定在芯片上，分析了噻嗪类化合物与该蛋白的亲和力，评价了它们相互作用的强弱。综合药效学、分子对接和分子互做的实验结果，总结了噻嗪类化合物的构效关系。发现噻嗪类化合物活性的强弱与是否开环、2位是否有取代、11位取代基的类型、数量、空间位阻等情况有关。利用流式细胞仪、荧光蛋白标记法和Western blot法检测了TNF-α诱导的RAFLS细胞凋亡、RAFLS细胞线粒体膜电位以及PI3K/Akt通路和线粒体通路中的主要蛋白的表达情况。研究结果表明，噻嗪类化合物可以通过抑制PI3K/Akt通路和增加线粒体膜通透性，促进TNF-α诱导的RAFLS细胞凋亡，从而发挥抗RA作用。本项目在阐明苍耳子抗RA药效物质基础的同时，发现具有新药开发前景的先导化合物，为噻嗪类化合物作为新型PI3Kγ抑制剂的研发提供理论基础，进而为充分开发利用苍耳子的药用资源和研制开发具有自主知识产权抗RA靶向药物提供科学的参考依据。.