基于钝齿棒状杆菌生物合成C6高级醇及烯醇的基础研究

Given the widely recognized unsustainability of depending solely on petroleum for development, the growing environmental pollution problem, and causing the international political problems by energy, increasing efforts and development of alternative sustainable clean energy become a focus of scientific researches, one of the most promising approach is that developing biosynthetic pathway to directly produce biofuels from renewable resources. In recent years, some success have been obtained via reconstructing new metabolic pathways into microbial platform to produce C4 ~ C5 higher alcohols, however, there no reports using Corynebacterium as producing platform to biosynthesize C6 higher alcohols and enol. In order to fit in with the requirement of new energy development in China’s national energy strategy, the project for the first time biosynthesize C6 higher alcohols and enol based on Corynebacterium as a production host by remaking metabolic pathways. Chemical characteristics of C6 higher alcohols and enol are closer to octane rating of gasoline than C4~C5 higher alcohols, are desired alternative energy for gasoline. The project will first screen targeted enzymes by constructing metagenomic library from plants, fungi, and obtain enzymes with high catalytic activity via modification of enzyme and directed evolution technology, then design and construct new metabolic pathways into Corynebacterium crenatum, optimize enzymes expression to produce C6 higher alcohols and enol: 3-methyl-1- amyl alcohol, n-hexanol and isoamyl enol, respectively. Finally, using the CRISPR-Cas9 gene editing system to control related genes of by-products, thus improve production of target objects. This project will provide a fundamental technology support for our country in terms of the biosynthesis of bioenergy field.

随着石化燃料的减少，环境污染问题日益严峻，及因能源引发的国际政治问题，开发可替代石油的可持续清洁能源成为各国科学发展的重点，而通过生物合成途径转化合成生物燃料是一个可行的途径之一。近年来，通过代谢途径工程改造微生物生产C4~C5高级醇已获得了成功，然而还没有基于利用棒状杆菌为合成平台生产C6高级醇以及烯醇的研究报告。为切合发展我国生物质新能源的国家战略需求，本项目首次研究基于棒状杆菌作为生产宿主，通过改造其代谢途径合成比C4~C5高级醇更为接近汽油辛烷值的C6高级醇及烯醇。本项目将通过构建宏基因组从植物，真菌中筛选、并通过酶定向进化获得高活性酶系，然后分别设计构建新代谢路径，优化酶表达合成C6高级醇的3-甲基-1-戊醇，n-己醇，和异戊烯醇，最后采用CRISPR-Cas9基因编辑系统对棒状杆菌相关基因进行删除，抑制从而提高产量。本项目为我国基于生物合成生物质能源提供基础技术支持。

随着石化燃料的减少，环境污染问题日益严峻，及因能源引发的国际政治问题，开发可替代石油的可持续清洁能源成为各国科学发展的重点，而通过生物合成途径转化合成生物燃料是一个可行的途径之一。为切合发展我国生物质新能源的国家战略需求，本项目首次研究基于棒状杆菌作为生产宿主，通过改造其代谢途径合成比C4~C5高级醇更为接近汽油辛烷值的C6高级醇及烯醇。本项目将通过构建宏基因组从植物，真菌中筛选、并通过酶定向进化获得高活性酶系，然后分别设计构建新代谢路径，优化酶表达合成C6高级醇的3-甲基-1-戊醇，n-己醇，和异戊烯醇。本项目为我国基于生物合成生物质能源提供基础技术支持。. 主要工作是围绕酶系的筛选、进化和基于大肠杆菌，棒状杆菌为工程宿主改造其代谢途径合成C2-C5醇的调查，这些工作为开发以钝齿棒状杆菌作为生物质能源生物合成的宿主平台提供了理论和技术支持，也为由我国科学家首次发现的菌株在国际微生物应用领域做出了一定的宣传与推广。已经进行了的研究工作具体包括：(1)高活性酶的筛选。（2）以载体pSTV29和pHSG298为基础通过克隆改造替换关键元件获得了适合棒状杆菌的表达的载体遗传系统。（3）以该载体系统为基础，通过随机突变改造棒状杆菌本身的合成能力，合成新的代谢途径，将其合成2-甲基-丁醇，3-甲基-1-戊醇，己醇，和异戊烯醇的产量分别达到4.0 g/L,1.2 g/L,0.87 g/L,和0.67 g/L左右，结果证明该工程菌在产C5醇方面尤其是2-甲基-1-丁醇具有一定的潜力。（4）在此前基础上，通过定点突变蛋白进化工程提高累积中间产物代谢途径的相关酶系的酶活，构建代谢途径进一步提高钝齿棒状杆菌工程菌合成C5高级醇2-甲基-1-丁醇的产量。（5）开发出来的一套适用于钝齿棒状杆菌遗传表达系统的一套遗传操作工具，做了改进后用于黄色短杆菌生物合成C4—C6高级醇获得成功，结果表明这套遗传表达系统对其他微生物宿主亦具有可用性.（6）也对关于合成高级能源在宿主上的研究和选择做了探索，以及在面对未来的能源领域的发展时，那些宿主最具有发展潜力的宿主进行了探讨，研究成果对于本项目为何选择钝齿棒状杆菌作为表达宿主做了分析.（6）除此以外，基于细菌和真菌生物合成长碳链高级能源关于碳链延长的模式的种类做了探讨，分析了碳链延长方式为将来的方式，为未来的深入研究奠定理论基础。