革氏链球菌AtlS蛋白在龋病防治中的分子生物学机制研究

革氏链球菌(S.g)是牙菌斑早期定植菌及有益菌，通过维护牙菌斑酸碱及菌群平衡对防止龋病发生具有重要作用。本课题组前期研究发现S.g AtlS蛋白不仅是形成正常细胞壁结构、生物膜及细菌自溶的关键蛋白；与细菌感受态形成、压力耐受也密切相关；并可发挥类细菌素的功能拮抗致龋菌，加入AtlS重组蛋白可增强S.g的生存竞争能力。申请者由此提出以S.g AtlS蛋白作为防龋靶点的新思路。本课题拟构建多种基因缺陷株与互补株，综合使用报告基因技术、Western-blot、蛋白重组与EMSA等技术，研究 ①S.g AtlS表达受哪些因素调控及其作用水平？②外界因素变化通过怎样的分子网络进行信号传递调控AtlS表达？③验证调控AtlS表达的关键基因与分子通路。 研究结果将有助于阐明调控S.g AtlS表达的分子生物学机制，对寻求促进S.g AtlS表达、提高S.g生存竞争力的防龋途径具有重要的理论和应用价值。

本实验通过检测 S.gordonii atlS 基因在不同生长期和生长条件下表达水平的差异及其蛋白活性，完成了分析调控S.gordonii atlS表达的因素的实验工作。收集不同生长期（对数生长早期、中期、晚期、稳定期）及不同生长条件（有氧、厌氧；pH 7.0、pH 5.5）中S.gordonii ATCC35105,常规方法提取总RNA。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法，以细菌的16SrRNA为内参照，分别测定atlS基因mRNA的相对表达量，比较S.gordonii在不同生长期及生长条件下atlS mRNA的表达水平。提取S.gordonii细胞壁肽聚糖，采用酶谱分析，分别检测AtlS蛋白水解细胞壁肽聚糖的活性，比较S.gordonii在不同生长期及生长条件下AtlS蛋白的活性。PCR及酶谱分析结果发现，atlS基因表达及细胞壁肽聚糖水解酶活性均从对数生长早期到稳定期逐步升高，有氧条件下atlS基因表达及细胞壁肽聚糖水解酶活性高于厌氧条件，中性条件下高于酸性条(P<0.05)。这表明S.gordonii atlS基因表达及水解酶活性受细菌生长期和条件因素（氧气和pH）的影响。以AtlS蛋白作为防龋靶点，深入研究调控atlS表达的分子生物学机制，有助于寻求促进S.gordonii atlS表达、提高S.gordonii生存竞争力的防龋途径。