杨树新生黄叶病害的病原鉴定

近年来，河南省等全国多个地区发生了大面积的杨树新生黄叶病害，形势十分危急。传染性实验证实一种未知病毒为该病害的相关病原。发病的直接原因为病株疏导系统受到破坏阻碍了营养元素的运输。项目拟对该病毒的分类地位和特性进行鉴定：采用单引物RT-PCR技术获得病毒cDNA、通过测序和生物信息学分析，完成病毒的分子鉴定；通过Western Blot，确定该病毒与已知病毒的血清学关系；将该病毒接种于鉴别植物并与已知病毒比较，确定病毒间亲缘关系；通过不同回接实验，确定病害的传播途径；将该病毒接种于普遍黄化的法桐等多种树种，研究其寄主范围；利用理化研究手段，确定病毒的分子量、钝化温度、体外存活期、核酸性质和衣壳蛋白分子量等；通过免疫胶体金技术，确定病毒在细胞和组织内的化学定位；采用电镜及化学染色技术，研究病毒感染造成的内部症状。研究结果可以确定该病毒的归属和性质，有助于该病害的检疫、防控及下一步致病机理研究。

近年来，河南省等全国多个地区发生了大面积的杨树黄叶病害，并造成了少数植株的死亡。黄叶病危害的杨树品种有7个主要品种，其中以107、108和三倍体毛白杨发病面积最大，且没有发现明显的抗病品种。在发病症状、发病规律、流行特点及防治效果等方面，此类黄叶病害与以往国内外报道过的杨树黄化病及花叶病均不相同。经专家会诊，确定为一种杨树新生黄叶病害。早期的切片结果表示发病的直接原因为病株疏导系统受到破坏阻碍了营养元素的运输，并在切片中发现了类似病毒的颗粒存在。因此本项目针对黄叶病发病现状展开了杨树黄叶病发病病原和病因的相关研究。本项目经过三年的研究取得了如下结果：1.通过双链RNA分析可知，在发病杨树内部含有植物病毒的核酸。核酸降解实验证明该核酸为dsDNA，SDS-PAGE显示该核酸稳定性和重现性较好。在此基础之上设计相关引物进行了核酸的克隆，由于前期对目的核酸的特性一无所知，所以实验重复了很多次均没有得到预期的结果，其原因目前正在进一步分析和研究。2. 实验采用了室内和室外相结合，嫁接、靠接和枯接等多种传染方式的方法进行了系统的传染性实验，结果说明该病害不具有明显的传染性。树体内发现的病毒类似物可能不是病害的主要病原，但它们存在加重了病情。3. 利用电镜技术研究了病树的内部症状。4. 采用双向电泳和MALDI-TOF-TOF 质谱联用技术进行了差异蛋白质组学研究，经图谱分析,在叶片、韧皮部和根部分别获得了98个(61个上调,37个下调)、90个(42个上调,48个下调)和41个(19个上调,22个下调)差异蛋白点。对其中差异表达1. 5倍以上的61个蛋白点进行了质谱鉴定,58个蛋白质点鉴定成功,这些蛋白点可归类于26种蛋白质。这些蛋白包括参与光合作用和与抗性相关的蛋白。研究结果有助于揭示病害的发生机理,铁蛋白的鉴定结果对病因的确定具有重要参考价值。5. 元素测定结果表明病树韧皮部中的铁蛋白大量消失，推测其原因是韧皮部中铁的含量十分低下以致其储存蛋白表达下降，该结果与补铁实验相一致，该结果具有重要价值。6. 食叶害虫杨扇舟蛾和分月扇舟蛾能够加重病害的发生，对虫害的控制有利于病害的综合防治。对害虫的杆状病毒病原进行了研究。以上研究结果有助于该病害的综合防控和进一步的致病机理研究。