高同型半胱氨酸介导经典Wnt信号通路相关基因DNA甲基化在先天性心脏病发生中的作用

高同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）是先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）发生的一个独立致畸因素，与经典Wnt信号通路基因异常表达相关，但确切机制未明。研究发现DNA甲基化参与了Wnt信号通路基因调节，高Hcy致CHD发生是否影响了此信号通路基因DNA甲基化尚不知晓。我们前期实验发现外源性Hcy致斑马鱼心脏发育异常，在此基础上显微注射Morpholino阻抑Hcy代谢关键酶基因表达，构建内源性高Hcy斑马鱼模型，采用整胚原位杂交及real-time PCR方法，描绘高Hcy介导经典Wnt信号通路相关基因的时空表达，进而行DNA甲基化测定，并研究叶酸补充对上述通路基因表达和甲基化的影响，从表观遗传学角度探讨高Hcy和经典Wnt信号通路如何发生交互作用。研究结果有助于今后进一步在CHD心脏实体中得以验证，指导育龄妇女高Hcy的针对性预防和治疗。

先天性心脏病在重大出生缺陷中顺位第一，其病因复杂，研究发现母亲高同型半胱氨酸血症可能与子代先天性心脏病的发生相关，但高同型半胱氨酸通过何种机制影响心脏发育目前尚缺乏深入的认识和结论。本课题通过构建外源性和内源性高同型半胱氨酸斑马鱼模型，用于进一步研究高同型半胱氨酸如何干扰心脏正常发育。发现无论外源性同型半胱氨酸还是内源性mthfr-MO基因抑制，都存在明显的剂量依赖性，低剂量下心脏畸形表型不明显，高剂量作用时出现心脏发育迟缓、心室腔较小、流出道血液淤积的表现，在同型半胱氨酸致心脏畸型上说明了斑马鱼较其他已报道的物种需要较高的剂量，也提示了同型半胱氨酸在心脏致畸剂量上存在一定的物种差异。进一步利用Cas9构建mthfr基因敲除模型，获得mthfr基因突变纯合体F2，在心肌细胞功能研究方面，发现在斑马鱼受精后12-20小时，应用blebbistatin阻断NM II功能诱导斑马鱼出现心脏二分叉表型，每个心脏独立搏动，并有各自独立的心房和心室，在分析心肌细胞的迁移过程中发现，心肌细胞前体迁移有重要作用的s1pr2表达下降，提示与中胚层发育异常相关，而不影响内胚层形成的foxa1的表达，为探索先天性心脏病的发生和早期预防与治疗提供了线索。