玉米叶夹角基因ZmCLA2-2的分子机制研究

Leaf angle is one of important agronomic traits affecting the yield in maize. Upright leaves can significantly improve photosynthetic efficiency and increase planting density, and then increase maize yield. As the breakthrough point in the study, ZmCLA2-2 of the major QTL qLA2-2 for leaf angle was cloned by Map-Based Cloning. T1 transgenic plants were obtained by maize genetic transformation. On this basis, the researches aim to validate the functions of candidate gene by association analysis and genetic transformation. The expression pattern and interaction proteins of the candidate gene will be studied by proteomic techniques and the protein interaction network will be constructed, which will suggest signal transduction of leaf angle formation. Differentially expressed genes will be identified and the relationships between the candidate gene and new identified genes will analyzed by the transcriptome sequencing. The structure, number, shape, size and other characteristics of the cells will identified from the cellular level. The implementation of this project will provide a theoretical basis not only for the corn density-tolerance high-yield breeding and molecular marker-assisted selection but also reference for biological functions of key genes in the interaction network during the formation of leaf angle.

玉米叶夹角是影响产量的最重要农艺性状之一，直立的叶片可显著提高光合效率、增加种植密度，进而增加产量。课题组以叶夹角为切入点，通过图位克隆技术获得qLA2-2的候选基因ZmCLA2-2，并通过遗传转化获得T1阳性转基因单株。在此基础上，本研究拟通过筛选纯合转基因株系和关联分析方法对其进行功能验证；利用蛋白质组学技术研究该基因的表达规律，发掘与其互作的蛋白和转录因子，并构建蛋白互作网络；利用转录组测序技术鉴定具有差异表达的新基因，并解析候选基因与新鉴定基因的关系；从细胞水平上分析叶夹角形成过程中细胞的结构、数目、形态、大小等特征。本项目实施不仅对玉米耐密高产育种及分子标记辅助选择提供理论依据，而且对解析叶夹角形成过程中关键基因在互作网络中调控的生物学功能提供参考。

叶夹角是影响玉米株型的关键性状之一。直立叶可增加种植密度，提高冠层光合速率，改善群体下部通风透光能力，增强根系活力，提高抗倒性，提高单位面积产量。本研究利用了一组由紧凑型和松散型的玉米自交系构建了一套近等基因系群体，并将一个位于第二染色体上控制叶夹角性状的QTL qLA2-2进行了精细定位，从而鉴定出属于bHLH家族的一个转录因子。利用玉米遗传转化获得ZmCLA2-2基因的过表达株系和CRISP-Cas9体系的突变体，过表达转基因株系与野生型相比，叶夹角比野生型大6-12度；突变体株系与野生型相比，叶夹角比野生型小10度左右。对候选基因ZmCLA2-2在双亲及近等基因系间存在差异的序列进行测序，结合2年的田间表型鉴定，结果表明，ATGTCC~/InDe、ATATAGGACCATATATTATGAT~/InDel和AAGCTA~/InDel的多态性与玉米叶夹角的大小显著关联。为明确ZmCLA2-2的互作调控关系，以ZmCLA2-2蛋白为诱饵，从以豫82为材料构建的酵母双杂交文库中筛选到GRMZM2G386113和GRMZM2G369912可能参与玉米叶夹角形成的相关基因，采用双分子荧光互补对CLA2-2的2个互作基因进一步印证了酵母双杂交试验的结果；以扩增出的ZmCLA2-2基因的启动子为诱饵，采用酵母单杂交技术从构建的文库中筛选到GRMZM2G086277、GRMZM2G089528、GRMZM5G836222、GRMZM5G866947可能与ZmCLA2-2相互作用。通过对DAP-Seq和RNA-Seq数据分析表明，ZmILI1不仅对生长素的极性运输、BR信号传导、细胞分裂素的应答和细胞分化相关的基因产生影响，而且还调节生长素和BR生物合成过程中的基因。特别是ZmILI1直接结合liguleless1 (LG1)的启动子，激活LG1，从而增大叶夹角，并发现ZmILI1和CYP90D1形成了一个新的负反馈环，维持了玉米中油菜素内酯的平衡。研究结利用多种分子生物学方法揭示了ZmILI1调控玉米叶夹角大小的分子机制，为解析玉米叶夹角形成提供理论依据。