唑来膦酸联合树突状细胞、γδT细胞免疫治疗肺癌的机制研究

Dendritic cell can restore the immune surveillance system of the lung cancer patients,and deliver tumor information to T-cell.γδT cell participates in the cellular immunity of tumor itself and preferentially cytotoxic to tumor cells, but is of small number in peripheral blood.Both of the above two cells are distinctly restrained by the growth of tumor cells of the lung cancer patients in function and number.Zoledronic acid can directly activate γδT cell,while dendritic cell as a kind of more effective antigen-presenting cell to deliver tumor information,can mediate zoledronic acid and activate γδT cell through inherent immunity.Our initial research indicates that zoledronic acid help in the maturation of dendritic cell phaenotype.This project will study the joint effect of adoptive cell therapy through γδT cell stimulated by zoledronic acid and dendritic cell immune surveillance to lung cancer.By in vivo and in vitro experiments, we will observe the complementary and superimposed effect of the γδT cell and dendritic cell joint therapy to tumor-bearing mice,and also observe its effect to facilitate apoptosis of lung cancer cell in tumor-bearing mice under different kinds of stimulation by applying advanced techniques including cell extraction,purification and amplification,tumor-bearing model,cytobiology,modern molecular immunology,lumimex analysis,so as to provide a new idea to restrain the tumor invasion and transfer in clinical treatment.

树突状细胞可恢复肿瘤患者体内免疫监控，并向T细胞呈递肿瘤信息。γδT细胞参与自身肿瘤细胞免疫，对肿瘤细胞有细胞毒杀伤作用，但在外周血中含量较少。两者在肿瘤患者体内均受肿瘤生长所影响，数量和功能受到明显抑制。唑来膦酸可以直接激活γδT细胞，而树突状细胞作为一种更为有效的抗原递呈细胞，可以介导唑来膦酸同时激活固有免疫应答的γδT细胞。我们前期研究显示唑来膦酸刺激可促进树突状细胞表型成熟，本项目考察以唑来膦酸激活的γδT细胞过继性治疗和树突状细胞免疫治疗联合对于肺癌的治疗效应，通过体外和体内实验两条途径，观察联合治疗在小鼠肺癌中的互补和叠加效果，应用细胞分离、纯化、扩增，荷瘤动物模型构建，细胞生物学与现代分子免疫学技术，Luminex分析等先进技术方法，观察在不同的刺激诱导方法下，γδT细胞和树突状细胞联合疗法对于促进荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的作用，为临床抑制肿瘤侵袭转移提供新的思路。

晚期肺癌的治疗方法及疗效有限，生物免疫治疗是一种有希望的治疗手段。γδT细胞回输是过继性免疫治疗的一种选择，但γδT细胞在体内含量极少。本课题旨在研究唑来膦酸刺激树突状细胞后诱导γδT细胞增殖的效果，并对其诱发机制进行进一步研究。本研究使用唑来膦酸刺激人外周血来源的树突状细胞，检测刺激后相关表面分子的表达及mRNA水平变化，用流式细胞仪检测诱导出γδT细胞的比例变化，并检测其对肺癌细胞株的杀伤能力。使用高效液相色谱串联质谱法检测不同条件刺激下标本上清中的异戊烯焦磷酸含量，以明确不同刺激条件与γδT细胞增殖的关系。对唑来膦酸刺激的树突状细胞提取RNA，进行全基因组表达谱芯片的检测，以分析唑来膦酸激活树突状细胞过程中的相应分子机制和下游通路。研究发现1 μmol/L的唑来膦酸刺激能部分减弱树突状细胞的成熟，表现在引起HLA-DR、CD80、CD86的比例降低，而树突状细胞特异性marker CD11c无变化。唑来膦酸刺激树突状细胞后可促进TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10和 IFN-γ等炎性因子分泌增加，并能诱导γδT细胞比例明显上升。同时γδT细胞相应的表征杀伤活性基因穿孔素、颗粒酶 B及CD107a水平上升，对不同肺癌细胞株杀伤效应同样增加。因为唑来膦酸可抑制胆固醇生成中的法尼基焦磷酸合成酶，增加唑来膦酸浓度可引起外周血及树突状细胞所产生的异戊烯焦磷酸含量升高，这可能是诱导γδT细胞比例升高的原因之一。美伐他汀能通过抑制HMG-CoA还原酶从而减少异戊烯焦磷酸含量。对唑来膦酸刺激的树突状细胞提取RNA，进行全基因组表达谱芯片的检测显示有796个基因显著下调，679个基因显著上调。上升最明显的基因是CXCL9和CXCL10。T细胞激活特别是γδT细胞的激活都有显著的富集。在γδT细胞激活的生物学过程中，基因STAT5B和NOD2都出现了下调。研究发现唑来膦酸能促进不成熟树突状细胞分泌抗肿瘤因子。唑来膦酸刺激不成熟树突状细胞后可明显的诱导γδT细胞发生增殖，这与唑来膦酸抑制法尼基焦磷酸合成酶引起异戊烯焦磷酸积聚相关。唑来膦酸刺激不成熟树突状细胞可引起CXCL9、CXCL等基因上调，激活γδT细胞后可下调STAT5B等基因从而发挥抗肿瘤效果。