蛋白质与生物纳米材料相互作用的动力学机制研究

Once nanoparticles enter bio-systems, they will immediately interact with various proteins, forming a protein coating shell called protein corona. Protein corona changes the identity of nanoparticles and even causes unexpected bio-effects, which is the major challenge for the bio-application and biosafety of nanomaterials. Therefore, the interaction between nanoparticles and proteins has been extensively studied in recent years. Yet, most studies focused on the thermodynamic aspects of the interaction. Since the interaction between nanoparticles and proteins is a kinetically controlled process, kinetic study is more critical and highly demanded. In this project, we are going to investigate the kinetics of the interaction between nanoparticles and proteins, focusing on the most important issue of the formation of the “hard” protein corona and the related direct interaction between nanoparticles and the first layer of proteins binding on their surface. To achieve this goal, we will synthesis core-shell nanoparticles with a fluorescent protein core and a well-controlled shell to keep the distance between the fluorescent core and the first layer of absorbed protein within 10 nm, while keep the distance between the fluorescent core and the second layer of absorbed protein larger than 10 nm, to specifically monitor the interaction between the nanoparticles with the first layer of proteins with fluorescence resonance energy transfer (FRET). The fast kinetics of the absorption/dissociation of the first layer of proteins will be illuminated by stop-flow FRET and other techniques. The mechanism of how the factors, such as particle size and functional groups, influence the formation/dissociation of the “hard” protein corona will also be investigated. And the results will be used to guide the functional design of nanoparticles with specific binding feature with targeted proteins to prevent the formation of “hard” protein corona and to improve the targeting effect for nanomedicines.

纳米材料进入生物体后将立即与各种蛋白质相互作用，并在纳米材料表面形成被称为蛋白冠的包裹层，由此产生的生物效应是纳米材料生物医学应用及其生物安全性评估的一个关键问题，因而纳米粒子与蛋白质相互作用研究近年来受到广泛关注。然而目前相关研究主要集中在热力学方面，动力学特别是快速动力学研究非常缺乏，而纳米粒子与蛋白质相互作用是一个动力学决定过程，动力学研究更为关键因而急待开展。本项目拟在前期工作基础上，开展蛋白质与纳米粒子相互作用的快速动力学研究：通过停流技术实现纳米粒子与蛋白质的毫秒级混合，通过精确控制包裹层厚度的荧光二氧化硅纳米粒子和与之结合的第一层蛋白质之间的荧光共振能量转移研究相互作用动力学规律，阐明对纳米粒子体内命运影响最大的硬蛋白冠的形成与解离机理，探索影响蛋白冠形成的因素及机制，并以此为指导初步探索纳米粒子表面与蛋白质特异性结合的功能设计，以期抑制硬蛋白冠的形成，提高纳米药物的靶向性。

纳米粒子与生物系统中蛋白质之间的相互作用是事关纳米材料生物安全和生物医学应用的重要基础问题。一般来说，纳米材料的潜在生物危害通常与纳米粒子-蛋白质的非特异性相互作用有关，而纳米材料的生物医学应用则往往需要发展特异性的纳米粒子-蛋白质相互作用以实现特定的生物医学目的，如纳米药物的主动靶向。因此，纳米材料生物医学应用的关键在于避免普遍存在的非特异性相互作用，同时开拓亟需的特异性相互作用。本课题以二氧化硅纳米粒子和金纳米粒子等典型纳米粒子为研究对象，在精确控制纳米粒子尺寸和表面功能基团的基础上，重点阐明蛋白冠形成早期的纳米粒子-蛋白质相互作用动力学（特别是蛋白质交换的动力学），以及特异性和非特异性的纳米粒子-蛋白质相互作用的热力学、动力学差异。我们还特别发展了一种构象工程方法，将天然抗体的CDR（互补决定区）肽重建到金纳米粒子上，制备得到一种全新的纳米人工抗体，我们称之为金抗体（Goldbody）。金抗体比天然蛋白质抗体更稳定，同时不存在天然抗体需要人源化的问题，因而我们工作在PNAS发表后，立即被F1000Prime推荐，并为我们的技术专门造了一个词“金化”（Goldization），以与“人源化”对应，暗示我们开发的新技术的潜在生物医学应用潜力。同时，金抗体首次为研究特异性的与非特异性的纳米粒子-蛋白质相互作用的差异提供了一个理想的系统，将金抗体上多肽的序列打乱，就得到完美的非特异性相互作用对照纳米粒子，这样一来，特异性和非特异性纳米粒子几乎完全一样，包括纳米粒子组成、形貌、及表面功能基团的组成（多肽氨基酸组成完全一样，只是序列不同）。利用这一系统，我们运用SPR、Stopped-flow等技术，揭示了特异性和非特异性NP蛋白相互作用在热力学和动力学上的显著差异。本课题完成了预定研究内容，发表SCI论文14篇，申请发明专利12项，获得专利授权2项。课题完成期间，1名学生获得博士学位，12名学生获得硕士学位，课题负责人以第三完成人获得了2018年度国家自然科学二等奖。