应用鼠源性高亲和力噬菌体Fab抗体筛选和克隆新的血清学H-Y 抗原基因

雄性特异性抗原（H-Y抗原）是引起同种雌性动物免疫排斥反应的物质的总称，并广泛存在于哺乳动物及其他脊椎动物。探索血清学H-Y抗原分子基础对深化性别分化调节、胎儿-母体免疫耐受和异性间组织移植免疫耐受等研究有重要意义。本课题将延续已成功构建的鼠源性H-Y噬菌体抗体库的研究，借助于申请者等在血清学H-Y抗原研究中所积累的技术经验，拟利用链替换和PCR 点突变技术对H-Y 抗原初级噬菌体抗体库进行亲和力提高，通过雄、雌鼠脾细胞的亲和吸附循环和噬菌体展示介导免疫PCR检测等方法筛选出高亲和力噬菌体Fab 抗体，然后利用该抗体对雌雄鼠脾细胞、早期胚胎的血清学H-Y 抗原功能性分子基础、表达分布和差异进行研究。所形成的研究结果将有助于揭示雄性特异性抗原、抗体的分子基础，拓展血清学H-Y抗原的应用潜能，为作用机理独特、具有复杂性的血清学H-Y抗原的相关研究和生产应用提供理论依据。

雄性特异性抗原（H-Y抗原）是引起同种雌性动物免疫排斥反应的物质总称，并广泛存在于哺乳动物及其他脊椎动物。本项目系统研究了H-Y噬菌体Fab抗体的亲和力提高以及血清学H-Y抗原候选分子的筛选和克隆。利用链替换、PCR 点突变、亲和吸附循环和噬菌体展示介导免疫PCR检测（PD-IPCR）等组合技术，构建了高亲和力H-Y 抗原次级噬菌体Fab抗体库，从亲和吸附循环最后一轮中随机挑取25个克隆制备噬菌体抗体，经细胞ELISA检测和PD-IPCR分析发现，链替换噬菌体抗体的亲和力提高，并筛选获得单株高亲和力噬菌体Fab 抗体B9阳性克隆，其亲和力和特异性明显强于噬菌体初级抗体库原始克隆；高亲和力噬菌体Fab 抗体B9的CDR3区序列的多个位点突变，参与噬菌体Fab 抗体亲和力提高；应用该高亲和力噬菌体 Fab抗体B9筛选获得了1个血清学H-Y抗原候选蛋白，表明高亲和力血清学H-Y抗原的噬菌体抗体库具有比传统抗体更强的雄性特异性蛋白筛选优势；同时研究发现血清学H-Y抗原候选蛋白具有雄性特异性，其抗体具有雄鼠脾细胞特异性识别的能力；利用血清学H-Y抗原候选蛋白的噬菌体Fab抗体分析发现，该候选蛋白在早期胚胎开始表达，雌雄胚胎差异明显，基于此表达模式可对鼠早期胚胎进行性别鉴定，其抗体展示出XY精子差异识别的潜力。这些重要研究进展和建立的技术体系为进一步开展具有复杂性的血清学H-Y抗原分子复合物的研究奠定实验基础和技术平台。所形成的研究结果丰富了血清学H-Y抗原、抗体的分子基础研究，拓展血清学H-Y抗原的应用潜能，对深化性别分化调节、胎儿-母体免疫耐受和异性间组织移植免疫耐受等研究有重要意义。