鼠疫耶尔森氏菌对Yep-phi噬菌体抗性的分子机制研究

Yersinia pestis is the causative agent of plague, a notorious infectious disease, which is also the Class-A infectious disease in China. Bacteriophage Ype-phi can specifically lyse Y. pestis, which qualified it as an important tool for the etiological diagnosis of plague in China. However, the underlying mechanisms of the specific lysis of Yep-phi to Y. pestis are still largely in mask. In this project, we are going to use an avirulent Y. pestis strain 614F as the model to partially elucidate this issue . By serial co-culturing with Yep-phi phage, we will induce Yep-phi resistant mutants of 614F. Thereafter, extensive comparative genomics and proteomic analysis on the resistant mutants and wild type 614F will reveal all the mutations, both on the genome level and proteome level. By carefully bioinformatics analysis, some candidates associated with phage resistance, probably membrane proteins, regulators and CRISPR-Cas will be selected for functional genomics verification. By using homology-recombination technology, the candidate genes will be knocked out from wild type 614F to find out whether the recombinants can reproduce the phage resistance phenotype. Corresponding complementary mutants will also be constructed to avoid possible polar effects and validate the role of the candidate. In this project, we aim to pinpoint some key proteins (loci) involved in the phage resistance mechanisms of Y. pestis, which will in turn provide clues for reconstruct the key steps of specific lysis of Ype-phi against Y. pestis. This project will provide fundamental data for the researches of Y. pestis and its phage, especially get insights of targets for further studies in terms of pathogen-host interactions.

鼠疫耶尔森氏菌（简称鼠疫菌）是我国甲类传染病-鼠疫的病原体，鼠疫噬菌体Yep-phi能够特异性的裂解鼠疫菌，是我国进行鼠疫病原学检测的重要依据之一；而鼠疫噬菌体针对鼠疫菌的特异性裂解机制目前仍然不明确。本研究拟利用已完成序列测定的鼠疫菌弱毒株614F，在Yep-phi噬菌体压力下连续培养，诱导出对Ype-phi具有抗性的突变株。随后利用比较基因组学和比较蛋白质组学，分析抗性突变菌株与野生型菌株的差异，重点观察膜蛋白、调控蛋白以及CRISPR-Cas系统，圈定可能与鼠疫菌中噬菌体抗性相关的蛋白质；针对选择出来的靶标基因，利用同源重组技术在野生株中进行敲除，观察能否出现噬菌体抗性，同时以回补株进行确认。通过本研究，有望确定一些在鼠疫菌中与噬菌体裂解抗性直接相关的蛋白，从宿主角度阐述噬菌体作用于鼠疫菌的关键步骤，初步明确鼠疫噬菌体与鼠疫菌相互作用过程中的关键环节，从而为后续更深入研究提供靶标。

鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种自然疫源性烈性传染病。在我国被规定为甲类传染病。鼠疫菌又是一种生物战剂和恐怖剂，威胁着人类的安全。因此鼠疫的防治对人民健康安全、经济发展和社会稳定具有重要意义。随着多重耐药菌株的出现，使噬菌体治疗得以重视。宿主菌与噬菌体“共进化”生活方式也是研究病原菌和宿主相互作用的理想模型。.本研究使用鼠疫弱毒菌614F，在Yep-phi噬菌体压力下连续培养，诱导出对Yep-phi具有抗性的突变株614F-S43。将614F-S43与共传代的614F的基因比对，发现waaA, ail，cmk基因发生突变。经弱毒株201对这三个基因进行无痕修饰后，进行相关表型实验，证实所发现的三个基因在噬菌体抗性中的发挥的作用。首先通过在鼠疫菌中建立无痕修饰技术平台，分别对waaA，ail，cmk三个基因进行单基因修饰，两两基因修饰和三基因修饰，得到7株突变株。分别是waaA（△9nt），cmk（△10nt），ail（△A），waaA（△9nt）/cmk（△10nt）, waaA（△9nt）/ ail（△A），cmk（△10nt）/ail（△A）和waaA（△9nt）/cmk（△10nt）/ail（△A）。通过表型实验观察了噬菌体对修饰菌株的感染能力、吸附能力、成斑能力，发现waaA（△9nt）的抗噬菌体能力与△waaA 相同，并强于野生株。提取LPS后发现waaA缺失9个碱基后鼠疫菌LPS的结构受到破坏。经蛋白信息学的分析和圆二色光谱的验证， WaaA（△9nt）蛋白比WaaA蛋白相比，结构发生改变，α螺旋增多，β折叠减少。由EditSeq软件分析和LC-MS/MS结果说明cmk的10个碱基缺失后，导致翻译提前终止，产生不完整蛋白，导致CMP/dCMP不能合成CDP/dCDP，影响宿主的Yep-phi不能获得CTP或dCTP作为噬菌体DNA聚合酶的底物，影响DNA的复制，从而起到抗噬菌体的作用。.本研究结果在病原-宿主相互作用的层面，解析鼠疫菌和噬菌体这对矛盾体在噬菌体裂解构成中的复杂变化，不仅可以加深我们对于鼠疫菌的认识，也可以为正在探索中的鼠疫菌的噬菌体疗法提供新的基础数据。