基于谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的过氧化物还原酶6（Prdx6）的分子改造及催化机制研究

GPx is a kind of important selenium-containing antioxidant protein and related to the occurrence and progression of many diseases. But limited availability and the difficulty of heterologous expression affect its development and application. In previous study, we obtained the GPx mutants with high activity, but the problem of its unstable property has not been solved. Prdx6 is a kind of peroxidase enzyme discovered in recent years, with a stable biological activity of GPx. But its activity is 2-4 orders of magnitude lower than that of native GPx and the mechanism of catalysis is unclear，which hinder its development to a certain extent. Therefore, the aim of this project is to improve the GPx catalytic activity of Prdx6 and clarify its catalytic mechanism. Cysteine auxotrophic expression system and site-directed mutation combining with computational simulation of protein structure analysis are used for the directed evolution of Prdx6. By comparing the differences of enzyme activities, protein structures and catalytic properties before and after modification, the function of amino acid residues in the active site of Prdx6 were systematically elucidated, and the catalytic mechanism of reducing peroxide with GSH as substrate was revealed. This study will significantly advance our understanding and application of Prdx6. The successful modification of Prdx6 is expected to replace the application of GPx in the field of medicine, and at the same time, it is of great academic significance and practical value in creating more diversified antioxidant enzymes.

GPx是一类重要的含硒抗氧化蛋白，但由于其天然来源有限、异源表达困难、性质不稳定等问题，至今未被良好的开发与应用。前期我们获得了活性较高的GPx突变体，但性质不稳定的问题仍未解决。Prdx6是近年来发现的一类过氧化物酶，本身具有GPx催化活性且性质稳定，但其GPx活性较天然GPx低2-4个数量级，相关催化机制尚不清楚。因此本项目以提高Prdx6的GPx催化活性，阐明其催化机制为目标。通过Cys缺陷表达、定点突变等手段结合计算机辅助模拟蛋白质结构分析对Prdx6进行分子改造。比较改造前后酶活性、蛋白质结构及催化性质等差异，系统阐述Prdx6催化活性中心氨基酸残基的功能，揭示其以GSH为底物还原过氧化物反应的催化机制。本项目不仅有助于Prdx6的深入研究及开发，而且成功改造的Prdx6有望代替GPx在医药领域的应用，与此同时对创造更加多样化的抗氧化酶具有重要的学术意义和实用价值。

过氧化物氧还蛋白是一类不断扩展的巯基特异的抗氧化蛋白家族，该蛋白家族通过其过氧化物酶活性还原或降解氢过氧化物、过氧化亚硝酸盐和多种有机氢过氧化物，进而在拮抗机体产生的活性氧、维持机体的氧化还原平衡上发挥重要作用。Prxs参与生物体中多个生物学功能。其家族成员Prdx6因其具有Gpx和PLA2双重酶活性，得到科研工作者的广泛关注。为了深入探索及改造Prdx6蛋白，本项目首先基于生物信息学网站对不同物种的Prdx家族成员进行分析，探究其家族成员的性质特征，总结分析Prdx家族蛋白的性质特点，发现该蛋白家族成员稳定性较差，且蛋白结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，为接下来Prdx6目标蛋白的改造提供了信息；通过PCR技术在基因库中调取Prdx6目的基因，利用基因重组技术构建pCold1-Prdx6表达载体，进一步通过大肠杆菌表达系统对Prdx6进行表达，并对其酶学性质进行表征，为后续深入改造该蛋白摸索条件；基于GPx催化特性，结合生物信息学分析结果，利用计算机辅助模拟蛋白结果，对Prdx6进行分子改造，筛选高活性突变体到了一个活性显著提高的突变体。我们在pColdI-PRDX6基础上将Ser32突变为Ala，使PRDX6在不影响其GPX活性的基础上，废除其PLA2活性构建突变体，进一步研究发现二者对心肌损伤具有一定的修复作用。与此同时，利用生物信息学网站对Prdx及GPx家族成员进行全面的分析及探究，发现二类抗氧化蛋白可以对某些癌症的发生和发展起重要作用。研究发现，PRDX6过表达可增强肝癌Hep G2和Hep3B细胞体外增殖、侵袭及迁移能力；此外，对胃组织切片研究显示，较正常胃组织相比，胃癌组织中PRDX6表达明显升高。在BGC-823细胞中敲除PRDX6 基因后明显抑制了胃癌BGC-823细胞的迁移和侵袭，该结果可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。基于该项目我们更深入的了解了Prdx蛋白和GPx蛋白的同工之处，为后续的深入研发奠定了基础。上述相关研究成果已发表论文5篇，其中SCI论文2篇，另有多篇论文在投稿中，且已接收SCI 1篇。