桉树菌根-崔娩克氏菌高效联合固氮体系的建立

桉树已成为我国南方最主要的人工林建设树种，面积达180万hm2。但桉树完全依赖施用氮肥和消耗土壤中的氮素生长,对地力消耗较大，桉树林地的氮素极度缺乏是实现桉树产业可持续发展的最大障碍。桉树接种固氮菌能促进其生长，但前期研究工作发现桉树形成菌根后对固氮菌（催娩克氏菌）有驱避作用。因此本项目主要研究内容为（1）以转座子[mTn5gusA-pgfp12]插入突变技术获得崔娩克氏菌对桉树菌根驱避源有耐受性或者有正向趋化性的突变株；（2）使崔娩克氏菌对桉树/彩色硬马勃菌根驱避源有反向运动能力（正向趋化性）的基因定位；（3）探索桉树苗固氮菌接种技术与菌根技术相结合的条件。

.　　催娩克氏菌是一种自生固氮菌，能与多种植物形成联合固氮体系，具有进一步开发利用的价值。桉树是我国重要的经济树种，其耗肥量大，也是菌根真菌彩色豆马勃的天然共生体之一。本项目以转座子mTn5gusA–pgfp21 对催娩克氏菌进行突变，筛选对桉树-彩色豆马勃共生体根系分泌物有强正趋性的突变体，尝试建立桉树—彩色豆马勃—催娩克氏菌三元互利共生体系。.　　　　先以0.1 μL/mL 和0.01 μL/mL 桉树油悬浮液筛选各突变体库剔除被桉树油强驱避者，结果获得对此2浓度趋化指数的平均值比野生株趋化指数提高3.33倍的突变体库（A库）。.　　在此基础上以溶液收集法收集桉树菌根分泌物作为趋化物对A 库突变体进一步筛选，得到对趋化物响应时间比野生株短的突变体菌株。选取固氮能力和长势与野生株相当者（K-M1），再用以同样方法收集桉树根、彩色豆马勃、桉树菌根分泌物（稀释成4 个浓度梯度，分别为：X，0.5X，0.2X，0.1X，X 为初始浓度）为趋化物对K-M1进行趋化检测，结果是其对桉树根分泌物的趋化指数在X 浓度下、对桉树菌根分泌物在4 个浓度下、对彩色豆马勃分泌物在0.2X，0.1X显著高于对野生株；因此确定K-M1为目的菌株。.　　以转座子mTn5gusA–pgfp21 的Gus 基因和IS50R 端各1 条引物对Age I 酶切的K-M1 基因组的自连产物进行反向PCR 得到一段3783 bp 的片段，Blast 比对结果显示其与假单胞杆菌Pseudomonas putida H8234的DNA序列有88%同源性，包含三个基因：①亚碲酸盐抗性蛋白基因，②ATP /GTP binding protein基因,③DEAD/DEAH box helicase 基因. 突变体中的mTn5gusA–pgfp21 插入位点仅1个,序列的进一步分析结果表明，插入位置是亚碲酸盐抗性蛋白基因。K-M1的功能互补株已经构建。.　　另外，本项目①鉴定了桉树实生苗（1月龄）枯萎病的病原菌尖刀镰孢菌及其发生危害的温度（25-30℃）、湿度（70-90%）等条件与其敏感的农药（惠生散），②揭示同一土壤发育条件下的连续种植甘蔗、松树、桉树的土壤微生物代谢活性的差异，③证明在MMN培养基基础上由葡萄糖为速效碳源、玉米粉作为长效碳源的培养基对彩色豆马勃菌的生长最为有利，菌落生长0.21±0