MmpS5–MmpL5外排系统在结核分枝杆菌对贝达喹啉耐药中的作用及机制研究

Bedaquiline is the first new tuberculosis drug, but the rapid emergence of bedaquiline resistant strains in tuberculosis patients urgently needs study for understanding the mechanisms of bedaquiline. Previously, we found bedaquiline resistance among isolates from tuberculosis patients with mutations in the Rv0678 gene, which encodes a transcription repressor of efflux pump MmpS5-MmpL5, causing overexpression of the efflux pump. However, the role of MmpS5-MmpL5 system in the mechanism of bedaquiline resistance to Mycobacterium tuberculosis is not clear. In this project, MmpS5, MmpL5 deletion and over-expression mutant will be constructed to investigate the function of these two proteins in bedaquiline resistance to tuberculosis. SPR and ITC methods will be used for exploring the interaction pattern between bedaquiline and MmpS5, MmpL5 protein. Next, we will compare the bedaquiline concentration between cytoplasm and membrane vesicles to provide the direct evidence for bedaquiline resistance by the efflux pump. In order to reveal the role of MmpS5-MmpL5 in the gradual resistance mechanism of bedaquiline, in vitro and in vivo models will be developed for simulating the emerge and progress of bedaquiline resistance. This study will further our understanding of bedaquiline resistance and provide a theoretical basis for the rational use of bedaquiline to avoid a surge of bedaquiline resistance.

贝达喹啉是近40年第一个抗结核新药，但是其临床耐药株的很快出现，迫切需要对其耐药机制进行研究。我们前期从结核患者体内分离出贝达喹啉耐药株，其Rv0678突变能引起外排泵mmpS5、mmpL5的表达增加，但是MmpS5-MmpL5系统在结核分枝杆菌对贝达喹啉耐药的转运机制以及在逐步耐药中的作用还不清楚。本研究拟构建MmpS5、MmpL5缺失和过表达突变体，阐明这两个外排泵蛋白分别在贝达喹啉耐药中的功能；采用SPR、ITC等方法研究贝达喹啉与MmpS5、MmpL5之间的相互作用方式。通过比较贝达喹啉在结核分枝杆菌细胞膜内和外膜囊泡内的浓度，为贝达喹啉通过外排泵耐药提供直接证据。运用体外、体内模型模拟贝达喹啉耐药的产生发展过程，揭示MmpS5-MmpL5在贝达喹啉逐步耐药中的作用。本课题将深化贝达喹啉的耐药机制研究，为贝达喹啉的合理用药，降低耐药发生率提供理论依据。

结核分枝杆菌对抗结核新药贝达喹啉的耐药与Rv0678突变有关，而Rv0678是MmpS5-MmpL5系统的抑制因子，MmpS5-MmpL5系统在结核分枝杆菌对贝达喹啉耐药中的作用和机制尚不清楚。本研究通过构建MmpL5、MmpS5、MmpS5-MmpL5在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌中的不同过表达菌株研究，基因敲除，以及全基因组学分析和比较蛋白质组学分析发现并证实了MmpS5和 MmpL5共表达才能导致贝达喹啉的耐药。通过分子对接研究，发现了MmpL5和贝达喹啉的结合关键位点。MmpS5-MmpL5降低外排泵底物溴化乙锭在菌体内的积累，证实了MmpS5-MmpL5具有外排能力，而没有MmpS5的MmpL5蛋白不能形成外排泵。贝达喹啉对表达MmpS5-MmpL5的菌体内ATP水平下降较少。通过H37Rv和Rv0678突变株体外暴露研究，表明了贝达喹啉耐药可能是逐步的，Rv0678突变是第一步，容易引起高水平耐药的atpE突变。动物体内研究提示大剂量贝达喹啉对Rv0678突变株有效。明确了MmpS5-MmpL5系统及其组成部分在结核分枝杆菌对贝达喹啉耐药中的作用，为MmpS5-MmpL5作为潜在的抗结核药物新靶点奠定了基础。逐步耐药及大剂量的贝达喹啉仍然有抗Rv0678突变株的活性，为合理使用贝达喹啉、减少耐药性的发生提供了依据。