断体再生期的地龙促进创面修复的物质基础和作用机制研究

Earthworm has a very strong capability of wound healing, regeneration and repairing，commonly used in the clinical treatment of burns. Preliminary studies show that large amounts of related substances promoting wound healing will secrete after the induction by the body broken. What's more, we have found that three protein bands have significantly capability to promote repairing and two of them directly belong to Oligochaeta Annelida.On the basis of preliminary studies, this topic is proposed to carry out the screening and separation of the active ingredient tracing through in vitro skin organ culture by using varieties of chromatographic techniques during the broken body regeneration stage. In addition, the regulation mechanism of active ingredient for the cells, factors and crosslinking effect between each other will be expored in the overall, the cellular and the molecular level. At the same time, fingerprint spectrum and related structural information of the earthworm's extract and its active component protein in broken body regeneration stage will be determined by the modern analytical techniques such as two-dimensional electrophoresis, MALD-TOF-MS, SELDI-TOF-MS, shotgun proteomics strategy, Western Blot testing and so on. Combining with the extract's expression mechanism in the wound repairing process, we would parse and reveal the biomarkers and material basis which promte the wound skin repairing in broken body regeneration stage. We expect the research's result will have a very far-reaching significance on human trauma.

地龙具有非常强的创伤愈合、再生修复能力，常用于烧烫伤的治疗。前期研究表明，地龙断体诱导后，会分泌大量与促进创面修复相关的物质，并发现了三条具有明显促进创面修复的蛋白条带，且有两个蛋白直接与寡毛纲环节动物门有关。本课题拟在前期研究基础上，通过体外皮肤器官培养示踪，采用多种层析技术，开展断体地龙再生期的活性成分筛选和分离，并从整体动物水平、细胞水平和生长因子水平，探讨活性成分对整体动物、细胞、生长因子及其相互之间网络作用的调控机制。同时，采用双向电泳、MALD-TOF-MS、SELDI-TOF-MS、shotgun蛋白组学策略、Western Blot检测等多种现代分析技术，测定断体再生期的地龙提取液及其活性组分的蛋白指纹表达谱和相关结构信息，结合其在创面修复过程中的机理表达，解析并揭示断体再生期的地龙促进创面修复的物质基础和作用机制。本课题的研究成果，将对人类的创伤研究具有非常深远意义。

本研究旨在从动物整体水平、细胞水平和生长因子水平，探讨活性成分对整体动物、细胞、生长因子及其相互之间网络作用的调控机制。同时，采用多种蛋白分离技术，结合电泳、LC-MS、Western Blot检测等多种现代分析技术，解析并揭示断体地龙促进创面修复的物质基础和作用机制。.1. 揭示断体再生期的地龙促进创面修复的物质基础.（1） SDS-PAGE、HPCE实验显示地龙断体三天时，其体内肽类成分明显增多，其提取液对HaCaT细胞、NIH3T3细胞增殖促进明显。（2）采用盐析、离子交换层析分离筛选得到活性蛋白组分。（3）考察了对活性蛋白稳定性的影响因素，证明30℃以下且中性pH环境中保存时，活性蛋白生物活性好，稳定性高。（4）活性蛋白组分通过LC-MS进行鉴定，结合NCBI Uniprot Eisenia fetida database和Uniprot Sprot database检索，鉴定得到25个蛋白，确定了断体地龙促进创面修复的物质基础。.2. 阐明所分离的活性成分促进创面修复的作用机理.（1） 建立了小鼠创伤模型，相对于空白对照组，阳性药物（bFGF）组及地龙活性蛋白组中伤口愈合速度较快，可明显看到表皮已经形成，成纤维细胞、血管细胞及毛囊较丰富。免疫组化研究表明，阳性组和实验组成纤维细胞生长因子（FGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达提前达到峰值且持续时间较长，表达量与对照组相比具有显著差异，表明断体地龙能促进FGF和VEGF表达，达到创伤愈合的作用。（2）地龙活性蛋白对HaCaT细胞、NIH3T3细胞增殖促进明显，活性蛋白组分通过LC-MS进行鉴定，用MASCOT检索NCBI Uniprot Eisenia fetida database和Uniprot Sprot database，得到25个蛋白。其中Keratin, type II cytoskeletal 1具有皮肤屏障、调控炎症反应及调节血管生成的作用；Heat shock protein 70具有抗细胞凋亡的作用，且受到外界刺激会分泌增加；Heat shock protein 90参与Ras/Raf通路的调节，该通路的下游通路ERK可直接调节细胞增殖分化，有利于创伤愈合与组织再生。.发表SCI文章2篇，核心期刊文章3篇，全国性学术会议论文2篇。培养硕士研究生2名（其中一名在读），在读博士1名。