二硫键异构酶在Notch受体活化过程中的作用机理

Notch receptors are widely expressed on the cell surface of multiple-cells animals and play pivotal role in many biological processes. Exposing of the Notch S2 site in the NRR(Negative Regulation Region, NRR), which can be cleaved by the metalloprotease, is the key rate-limiting step for the activation of Notch receptor. The mechanism of the S2 site exposing is remaining unclearly. Study of the structure of NRR suggests the broken of the 10th disulfide in NRR can be the key point of the exposing of S2. It indicates the PDI (Protein Disulfide Isomerase, PDI) may play an important role for notch1 activation, not just a witness. No hypothesis mention the role of the PDI in the process of the S2 site exposing before. We found the activating of Notch induced by EDTA, could be inhibited by treat the cells with DTNB, a specific inhibitor of the PDI located on the cell membrane. Based on these facts, we propose the experiments about the PDI which may play a necessary role in the process of the Notch activating on the cells. We use Notch1 as the first receptor been studied: 1) Screen and identify the specific PDI, which participate the process of Notch1 activation. 2) Reveal the mechanism of the PDI processing the special disulfide bond on NRR in the process of Notch1 activation. These experiments will clarify the role of the PDI in the process of the Notch activation, also be a compensation of the theory of Notch activation to show the ingenious beauty of life. Further study on the new drug based on the new target of Notch receptor is proposed.

Notch受体在多种生命过程中发挥着重要作用。其紧密的负调节区域(NRR)如何打开,进而暴露能够被金属蛋白酶切割的S2位点是Notch活化的限速步骤,机制尚不清楚。NRR的晶体结构显示，第10对二硫键可能是NRR打开的关键环节,提示蛋白二硫键异构酶(PDI)可能参与Notch的活化过程。这在现有假说没有涉及。研究发现,用作用于细胞膜表面PDI的特异性抑制剂DTNB处理细胞抑制了EDTA介导的Notch的活化,提示PDI的确参与了Notch的活化过程。据此,拟以Notch1为代表研究确定Notch活化过程中可能起关键作用的PDI。主要内容如下:1对参与Notch1受体活化的PDI种类进行筛选确定；2明确该PDI参与Notch1受体活化的分子机制。研究成果可阐明PDI在Notch活化过程中的作用,展现精巧生命之美,是Notch活化机制的完善和和补充,还为以Notch为靶点的药物研究提供新思路。

Notch受体活化的关键步骤是深埋于Notch负调节区 (NRR) 的S2位点暴露。NRR晶体结构显示，其第10对二硫键位置特殊，若打开则直接导致S2位点暴露。蛋白二硫键异构酶PDI可催化二硫键打开。研究内容如下：.1.用2种只作用于细胞膜上的PDI抑制剂（DTNB和Bacitracin）都能够显著抑制EDTA诱导的Notch1活化，表明PDI确实在Notch1受体活化过程中发挥了重要作用。.2.采用化学交联方法，确定了细胞膜表面与Notch1形成复合体的二硫键异构酶是ERp。.3. RNAI实验表明降低细胞膜表面ERp5的表达可以抑制Notch1的活化。.4.添加重组ERp5（r-ERp5）能够增强Nocth1的活化。.5.为验证ERp5介导NRR1二硫键的还原，将重组的ERp5蛋白与NRR1蛋白进行室温孵育，在EDTA存在时，ERp5能够部分还原NRR1。分子互作结果显示重组的ERp5蛋白与NRR1蛋白有相互作用，其亲和力常数KD=0.73μM。当NRR1蛋白加入EDTA后，分子互作结果显示，在EDTA存在的情况下，重组ERp5与NRR1蛋白亲和力常数降低KD=1.7μM。这些结果表明EDTA诱导NRR1的构像发生改变后，ERp5才能够部分还原NRR1。.6. ERp5包含2个CGHC活性位点，通过制备单一ERp5结构域蛋白、逐一失活催化位点的ERp5蛋白进行实验研究，确认了其两个催化位点在体外都能够部分还原NRR1。.7.通过转染ERp5（分别编码突变失活的催化基序）进入细胞，进行实验研究，结果表明ERp5的2个催化基序在细胞上都能够促进Notch1活化，与体外孵育结果相一致。.8. NRR1第10对二硫键突变（C-S）后（命名为NRR10）,ERp5失去了对NRR10的催化能力。表明ERp5确实是作用于NRR1上的第10对二硫键。.综上所述，我们首次阐明了二硫键异构酶在Notch1受体活化中的作用机理。EDTA螯合Ga2+ 或者配体结合只不过是ERp5发挥作用的前提条件。ERp5通过还原NRR1第10对二硫键，导致NRR1的结构完全展开暴露出关键的S2位点，从而促进Notch1受体活化。该机制的阐明将对现有的一系列Notch活化机制进行解释说明，为以Notch1受体为靶点的药物开发和临床应用提供新的治疗策略。