一氧化氮维持细胞自噬水平促进胰腺癌神经浸润发生的实验研究

Perineural invasion (PNI) is one of the main clinical features of pancreatic cancer, and mechanisms of its development is unclarified. Nitric oxide (NO) stress present multiple effects the proliferation and invasion of cancer cells, but its role in perineural invasion of pancreatic cancer cells has not been documented. Our study showed that the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was high in pancreatic cancer, and was closely related to PNI. We speculate that the pancreatic cancer cells invade into nervous tissue due to NO pressure and a variety of physical and molecular mechanisms, and then NO in nerve tissue that upregulate survival signaling pathways and change cell autophagy of the cancer cells may participate in the maintenance of these resident cells having the ability to PNI and spread from pancreas to other organs. In this study, we will use clinical pathological analysis, cancer cells-nerver tissue coculture and cancer cells-vagus nerve invasion model in vitro, and the nude mice model of pancreatic cancer nodules-sciatic nerve infiltration. In final, the study will document and simulate the process of pancreatic cancer nerve invasion clinically, cellularly, molecularly and in experimenal animals to validate the hypothesis of NO promoting pancreatic cancer PNI via activation of survival signal pathway maintenance of cell autophagy. The completion of this study will provide new ideas for the prevention and treatment of pancreatic cancer.

神经浸润(PNI)是胰腺癌的主要临床特征之一，其发生机制不明。研究证实一氧化氮（NO）可影响癌细胞的增殖侵袭，但在胰腺癌PNI中的作用未见相关报道。我们的前期研究发现诱导型NO合酶（iNOS）在胰腺癌组织中高表达，与PNI密切相关；NO可促进胰腺癌细胞迁移、侵袭及自噬。我们推测胰腺癌细胞通过包括NO信号分子等多种分子机制向神经发生迁移浸润，癌细胞侵入神经组织新环境后，NO参与上调癌细胞生存信号改变细胞自噬水平维持这些定植癌细胞的增殖活性及能量供应，继而使癌细胞能继续沿神经浸润，向胰腺外转移。本研究应用临床病理分析、体外癌细胞-新生大鼠背根神经节共培养、癌细胞-乳大鼠迷走神经浸润模型、及体内裸鼠胰腺癌瘤块坐骨神经浸润模型在临床、细胞、分子、动物水平阐释和模拟胰腺癌神经浸润过程及其分子机制，验证NO参与活化生存信号和维持细胞自噬促进胰腺癌神经浸润的假说，为胰腺癌临床防治提供新思路。

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，因其恶性程度高、进展快、根治性手术率低、术后易复发，化放疗效果有限等特点，死亡率几乎与发病率相等。神经浸润（perineural invasion, PNI）在胰腺癌中发生率极高，可达80%-100%，是导致胰腺癌转移和术后复发的一个重要因素。胰腺癌发生PNI的主要学说为胰腺癌嗜神经生长机制，这种机制尚无明确定论。我们的前期研究证实一氧化氮（NO）可影响癌细胞的增殖侵袭，但在胰腺癌PNI中的作用尚不明确。3年来，课题组围绕一氧化氮维持细胞自噬水平促进胰腺癌PNI发生进行了深入系统的基础研究。主要研究内容：通过临床病理分析研究了NO对胰腺癌PNI发生的影响；体外实验模拟胰腺癌细胞嗜神经生长过程研究了NO对胰腺癌细胞侵袭神经能力的影响；体内实验构建裸鼠胰腺癌瘤块坐骨PNI模型研究了NO对胰腺癌PNI的影响及其分子机制；重要结果及关键数据：自噬相关蛋白LC3表达与胰腺癌PNI及淋巴结转移密切相关（P<0.05），在PNI阳性组，LC3表达与eNOS表达密切相关（P<0.05），LC3表达是影响胰腺癌PNI的独立因素，且LC3表达和PNI是影响胰腺癌患者预后的独立因素。提示胰腺癌自噬可能影响PNI发生；BxPC-3、SW1990胰腺癌细胞-大鼠背根神经节共培养结果发现，癌细胞沿神经丝向大鼠背根神经节方向迁移生长、背根神经节神经丝向癌细胞方向生长，两者呈交互生长模式，应用NO供体DETA/NO干预可见交互生长增加（P<0.05），而应用MEK1/2抑制剂U0126及自噬抑制剂氯喹干预可明显逆转DETA/NO诱导的癌细胞-背根神经节交互生长（P<0.05）。提示NO可能通过上调自噬和活化MAPK信号通路促进PNI发生；BxPC-3、SW1990胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤瘤块坐骨PNI模型研究结果显示：BxPC-3、SW1990皮下成瘤良好，瘤块接种后向坐骨神经生长，经组织病理及电镜检查显示DETA/NO可促进胰腺癌瘤块成活及发生PNI，而iNOS抑制剂1400W及氯喹则相反（P<0.05）。科学意义：本项目通过在临床、细胞、分子、动物水平揭示胰腺癌PNI过程及其分子机制，验证了NO参与维持细胞自噬和活化生存信号促进胰腺癌PNI，为阐释胰腺癌PNI机制提供新依据，及为NO调节治疗胰腺癌提供新启示。